Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés

La phagocytose quotidienne des segments externes du photorécepteur par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) contribue à l’accumulation d’un pigment de vieillissement intracellulaire appelé lipofuscine. La toxicité de la lipofuscine est bien établie dans la maladie de Stargardt, la dégénérescence rétinienne héréditaire la plus courante, mais est plus controversée dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans le monde développé. Déterminer la toxicité de la lipofuscine chez l’homme a été difficile, et les modèles animaux de Stargardt ont une toxicité limitée. Ainsi, des modèles in vitro qui imitent l’EPR humain in vivo sont nécessaires pour mieux comprendre la génération, la clairance et la toxicité de la lipofuscine. La majorité des modèles de lipofuscine de culture cellulaire à ce jour ont été dans des lignées cellulaires ou ont impliqué l’alimentation en EPR d’un seul composant du mélange complexe de lipofuscine plutôt que de fragments / pointes de l’ensemble du segment externe du photorécepteur, ce qui génère un modèle lipofuscine plus complet et physiologique. La méthode décrite ici est une méthode pour induire l’accumulation de matériel de type lipofuscine (appelé matériau d’autofluorescence non digestible, ou UAM) dans l’EPR prénatal primaire humain hautement différencié (hfRPE) et l’EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (CSPi). L’UAM s’est accumulée dans les cultures par des alimentations répétées de fragments de SG traités à la lumière ultraviolette absorbés par l’EPR par phagocytose. Les principales façons dont UAM se rapproche et diffère de la lipofuscine in vivo sont également discutées. Parallèlement à ce modèle d’accumulation de type lipofuscine, des méthodes d’imagerie permettant de distinguer le large spectre d’autofluorescence des granules UAM de la coloration simultanée des anticorps sont introduites. Enfin, pour évaluer l’impact de la MNA sur la capacité de phagocytose de l’EPR, une nouvelle méthode de quantification de l’absorption et de la dégradation des fragments et des pointes du segment externe a été introduite. Appelée « capacité totale de consommation », cette méthode permet de surmonter les erreurs potentielles d’interprétation de la capacité de phagocytose de l’EPR inhérentes aux tests classiques de « chasse au pouls » du segment externe. Les modèles et les techniques présentés ici peuvent être utilisés pour étudier les voies de génération et de clairance de la lipofuscine et la toxicité putative.