Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

La fagocitosi quotidiana dei segmenti esterni dei fotorecettori da parte dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) contribuisce all'accumulo di un pigmento di invecchiamento intracellulare chiamato lipofuscina. La tossicità della lipofuscina è ben consolidata nella malattia di Stargardt, la più comune degenerazione retinica ereditaria, ma è più controversa nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nel mondo sviluppato. Determinare la tossicità della lipofuscina nell'uomo è stato difficile e i modelli animali di Stargardt hanno una tossicità limitata. Pertanto, sono necessari modelli in vitro che imitano l'RPE umano in vivo per comprendere meglio la generazione, la clearance e la tossicità della lipofuscina. La maggior parte dei modelli di lipofuscina di colture cellulari fino ad oggi sono stati in linee cellulari o hanno coinvolto l'alimentazione di RPE con un singolo componente della miscela complessa di lipofuscina piuttosto che frammenti / punte dell'intero segmento esterno del fotorecettore, che genera un modello di lipofuscina più completo e fisiologico. Qui è descritto un metodo per indurre l'accumulo di materiale simile alla lipofuscina (definito materiale di autofluorescenza indigeribile, o UAM) in RPE prenatale umano primario altamente differenziato (hfRPE) e RPE derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'UAM si è accumulata nelle colture mediante ripetute alimentazioni di frammenti di OS trattati con luce ultravioletta assorbiti dall'RPE tramite fagocitosi. Vengono anche discussi i modi chiave in cui UAM si avvicina e differisce dalla lipofuscina in vivo . Accompagnando questo modello di accumulo simile alla lipofuscina, vengono introdotti metodi di imaging per distinguere l'ampio spettro di autofluorescenza dei granuli di UAM dalla concomitante colorazione anticorpale. Infine, per valutare l'impatto dell'UAM sulla capacità di fagocitosi RPE, è stato introdotto un nuovo metodo per quantificare l'assorbimento e la rottura di frammenti/punte del segmento esterno. Definito "Total Consumptive Capacity", questo metodo supera potenziali interpretazioni errate della capacità di fagocitosi RPE inerente ai classici saggi di "inseguimento a impulsi" del segmento esterno. I modelli e le tecniche qui introdotte possono essere utilizzati per studiare la generazione di lipofuscina e le vie di clearance e la tossicità putativa.