Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantifisering av fagocytosekapasitet i høyt polariserte humane retinale pigmentepitelkulturer

Den daglige fagocytosen av fotoreceptorens ytre segmenter av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar til akkumulering av et intracellulært aldringspigment kalt lipofuscin. Toksisiteten av lipofuscin er godt etablert i Stargardts sykdom, den vanligste arvelige retinal degenerasjonen, men er mer kontroversiell i aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), den ledende årsaken til irreversibel blindhet i den utviklede verden. Bestemmelse av lipofuscintoksisitet hos mennesker har vært vanskelig, og dyremodeller av Stargardts har begrenset toksisitet. Derfor er in vitro-modeller som etterligner human RPE in vivo nødvendig for bedre å forstå lipofuscingenerering, clearance og toksisitet. Flertallet av cellekulturlipofuscinmodeller hittil har vært i cellelinjer eller har involvert fôring av RPE en enkelt komponent av den komplekse lipofuscinblandingen i stedet for fragmenter / tips av hele fotoreceptorens ytre segment, noe som genererer en mer komplett og fysiologisk lipofuscinmodell. Beskrevet her er en metode for å indusere akkumulering av lipofuscinlignende materiale (kalt ufordøyelig autofluorescensmateriale, eller UAM) i høyt differensiert primær human prenatal RPE (hfRPE) og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) avledet RPE. UAM akkumulert i kulturer ved gjentatte tilførseler av ultrafiolette lysbehandlede OS-fragmenter tatt opp av RPE via fagocytose. De viktigste måtene som UAM tilnærmer seg og skiller seg fra lipofuscin in vivo diskuteres også. Sammen med denne modellen av lipofuscinlignende akkumulering innføres avbildningsmetoder for å skille det brede autofluorescensspekteret av UAM-granulater fra samtidig antistofffarging. Til slutt, for å vurdere virkningen av UAM på RPE-fagocytosekapasitet, er det innført en ny metode for å kvantifisere ytre segmentfragment / tipsopptak og sammenbrudd. Kalt "Total Consumptive Capacity", overvinter denne metoden potensielle feiltolkninger av RPE-fagocytosekapasitet som ligger i klassiske ytre segment "pulsjakt" analyser. Modellene og teknikkene introdusert her kan brukes til å studere lipofuscingenerering og clearanceveier og antatt toksisitet.