Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

La fagocitosis diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores por el epitelio pigmentario de la retina (EPR) contribuye a la acumulación de un pigmento de envejecimiento intracelular denominado lipofuscina. La toxicidad de la lipofuscina está bien establecida en la enfermedad de Stargardt, la degeneración retiniana hereditaria más común, pero es más controvertida en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado. Determinar la toxicidad de la lipofuscina en humanos ha sido difícil, y los modelos animales de Stargardt tienen una toxicidad limitada. Por lo tanto, se necesitan modelos in vitro que imiten el EPR humano in vivo para comprender mejor la generación, eliminación y toxicidad de la lipofuscina. La mayoría de los modelos de lipofuscina de cultivo celular hasta la fecha han estado en líneas celulares o han implicado alimentar al EPR con un solo componente de la mezcla compleja de lipofuscina en lugar de fragmentos/puntas de todo el segmento externo de los fotorreceptores, lo que genera un modelo de lipofuscina más completo y fisiológico. Aquí se describe un método para inducir la acumulación de material similar a la lipofuscina (denominado material de autofluorescencia no digerible, o UAM) en RPE prenatal humano primario altamente diferenciado (hfRPE) y RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La UAM se acumuló en cultivos mediante la alimentación repetida de fragmentos de SG tratados con luz ultravioleta absorbidos por el EPR a través de fagocitosis. También se discuten las formas clave en que UAM se aproxima y difiere de la lipofuscina in vivo . Acompañando a este modelo de acumulación similar a la lipofuscina, se introducen métodos de imagen para distinguir el amplio espectro de autofluorescencia de los gránulos de UAM de la tinción concurrente de anticuerpos. Finalmente, para evaluar el impacto de UAM en la capacidad de fagocitosis del EPR, se ha introducido un nuevo método para cuantificar la captación y descomposición de fragmentos / puntas del segmento externo. Denominado "capacidad consuntiva total", este método supera posibles interpretaciones erróneas de la capacidad de fagocitosis del EPR inherente a los ensayos clásicos de "persecución de pulsos" del segmento externo. Los modelos y técnicas introducidos aquí se pueden utilizar para estudiar las vías de generación y eliminación de lipofuscina y la toxicidad putativa.