Förbättrade lipofuscinmodeller och kvantifiering av fagocytoskapacitet i yttre segmentet i högpolariserade humana retinala pigmentepitelkulturer

Den dagliga fagocytosen av fotoreceptorns yttre segment av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar till ackumuleringen av ett intracellulärt åldringspigment som kallas lipofuscin. Toxiciteten av lipofuscin är väl etablerad i Stargardts sjukdom, den vanligaste ärftliga retinal degeneration, men är mer kontroversiell i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den främsta orsaken till irreversibel blindhet i den utvecklade världen. Att bestämma lipofuscintoxicitet hos människor har varit svårt, och djurmodeller av Stargardts har begränsad toxicitet. Således behövs in vitro-modeller som efterliknar human RPE in vivo för att bättre förstå lipofuscingenerering, clearance och toxicitet. Majoriteten av cellodlingslipofuscinmodeller hittills har varit i cellinjer eller har involverat matning av RPE en enda komponent i den komplexa lipofuscinblandningen snarare än fragment / spetsar av hela fotoreceptorns yttre segment, vilket genererar en mer komplett och fysiologisk lipofuscinmodell. Här beskrivs en metod för att inducera ackumulering av lipofuscinliknande material (benämnt osmältbart autofluorescensmaterial, eller UAM) i högdifferentierad primär human prenatal RPE (hfRPE) och inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iPSC). UAM ackumuleras i kulturer genom upprepade matningar av ultraviolett ljusbehandlade OS-fragment som tas upp av RPE via fagocytos. De viktigaste sätten som UAM approximerar och skiljer sig från lipofuscin in vivo diskuteras också. Tillsammans med denna modell av lipofuscinliknande ackumulering introduceras avbildningsmetoder för att skilja det breda autofluorescensspektrumet av UAM-granuler från samtidig antikroppsfärgning. Slutligen, för att bedöma effekten av UAM på RPE-fagocytoskapacitet, har en ny metod för att kvantifiera upptag och nedbrytning av yttre segmentfragment / spetsar introducerats. Benämnd "Total konsumptiv kapacitet", denna metod övervinner potentiella feltolkningar av RPE-fagocytoskapacitet som är inneboende i klassiska yttre segment "pulsjakt" -analyser. De modeller och tekniker som introduceras här kan användas för att studera lipofuscingenerering och clearancevägar och förmodad toxicitet.