Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantificering af ydre segment fagocytosekapacitet i stærkt polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer

Den daglige fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter af retinal pigmentepitel (RPE) bidrager til akkumulering af et intracellulært aldringspigment kaldet lipofuscin. Toksiciteten af lipofuscin er veletableret i Stargardts sygdom, den mest almindelige arvelige retinal degeneration, men er mere kontroversiel i aldersrelateret makuladegeneration (AMD), den førende årsag til irreversibel blindhed i den udviklede verden. Det har været vanskeligt at bestemme lipofuscintoksicitet hos mennesker, og dyremodeller af Stargardts har begrænset toksicitet. Således er in vitro-modeller , der efterligner human RPE in vivo , nødvendige for bedre at forstå lipofuscingenerering, clearance og toksicitet. Størstedelen af cellekulturlipofuscinmodeller til dato har været i cellelinjer eller har involveret fodring af RPE en enkelt komponent i den komplekse lipofuscinblanding snarere end fragmenter / spidser af hele fotoreceptorens ydre segment, hvilket genererer en mere komplet og fysiologisk lipofuscinmodel. Her beskrives en metode til at inducere akkumulering af lipofuscinlignende materiale (kaldet ufordøjeligt autofluorescensmateriale eller UAM) i stærkt differentieret primær human prænatal RPE (hfRPE) og induceret pluripotent stamcelle (iPSC) afledt RPE. UAM akkumuleret i kulturer ved gentagen fodring af ultraviolette lysbehandlede OS-fragmenter optaget af RPE via fagocytose. De vigtigste måder, hvorpå UAM tilnærmer sig og adskiller sig fra lipofuscin in vivo , diskuteres også. Ledsaget af denne model af lipofuscinlignende akkumulering introduceres billeddannelsesmetoder til at skelne det brede autofluorescensspektrum af UAM-granulat fra samtidig antistoffarvning. Endelig er der indført en ny metode til kvantificering af optagelse og nedbrydning af ydre segmentfragment/spidser for at vurdere virkningen af UAM på RPE-fagocytosekapaciteten. Betegnes "Total Consumtive Capacity", denne metode overvinder potentielle fejlfortolkninger af RPE fagocytose kapacitet iboende i klassiske ydre segment "puls-chase" assays. De modeller og teknikker, der introduceres her, kan bruges til at studere lipofuscingenerering og clearance veje og formodet toksicitet.