Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente durch das retinale Pigmentepithel (RPE) trägt zur Akkumulation eines intrazellulären Alterungspigments bei, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Die Toxizität von Lipofuszin ist bei Morbus Stargardt, der häufigsten erblichen Netzhautdegeneration, gut belegt, ist aber bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, umstrittener. Die Bestimmung der Lipofuszin-Toxizität beim Menschen war schwierig, und Tiermodelle von Stargardt weisen eine begrenzte Toxizität auf. Daher werden In-vitro-Modelle benötigt, die humanes RPE in vivo nachahmen, um die Bildung, Clearance und Toxizität von Lipofuszin besser zu verstehen. Die meisten bisherigen Liofuszin-Modelle in Zellkulturen wurden in Zelllinien oder mit einer einzigen Komponente der komplexen Lipofuszinmischung gefüttert, anstatt mit Fragmenten/Spitzen des gesamten äußeren Segments des Photorezeptors, wodurch ein vollständigeres und physiologischeres Lipofuszin-Modell entsteht. Hier wird eine Methode beschrieben, um die Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichem Material (unverdauliches Autofluoreszenzmaterial oder UAM) in hochdifferenzierten primären humanen pränatalen RPE (hfRPE) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten RPE zu induzieren. UAM, akkumuliert in Kulturen durch wiederholte Fütterung von mit ultraviolettem Licht behandelten OS-Fragmenten, die vom RPE über Phagozytose aufgenommen wurden. Die wichtigsten Möglichkeiten, wie sich UAM in vivo Lipofuszin annähert und von diesem unterscheidet, werden ebenfalls diskutiert. Begleitend zu diesem Modell der Lipofuscin-ähnlichen Akkumulation werden bildgebende Verfahren zur Unterscheidung des breiten Autofluoreszenzspektrums von UAM-Granula von gleichzeitiger Antikörperfärbung vorgestellt. Um den Einfluss von UAM auf die RPE-Phagozytosekapazität zu bewerten, wurde schließlich eine neue Methode zur Quantifizierung der Aufnahme und des Abbaus von Fragmenten/Spitzen des äußeren Segments eingeführt. Diese Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, überwindet mögliche Fehlinterpretationen der RPE-Phagozytose-Kapazität, die klassischen "Pulse-Chase"-Assays im äußeren Segment innewohnen. Die hier vorgestellten Modelle und Techniken können verwendet werden, um die Entwicklung und Clearance von Lipofuszinen sowie die mutmaßliche Toxizität zu untersuchen.