Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

Abstract

הפאגוציטוזה היומית של המקטעים החיצוניים של קולטני האור על ידי אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תורמת להצטברות פיגמנט הזדקנות תוך תאי המכונה ליפופוסצין. הרעילות של ליפופוסצין מבוססת היטב במחלת סטארגארדט, ניוון הרשתית התורשתי הנפוץ ביותר, אך שנויה יותר במחלוקת בניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך בעולם המפותח. קביעת רעילות ליפופוסצין בבני אדם הייתה קשה, ולמודלים של בעלי חיים של סטארגארדט יש רעילות מוגבלת. לכן, מודלים במבחנה המחקים RPE in vivo אנושי נדרשים כדי להבין טוב יותר את יצירת ליפופוסצין, פינוי ורעילות. רוב המודלים של ליפופוסצין בתרבית תאים עד כה היו בקווי תאים או כללו הזנת RPE ברכיב יחיד של תערובת ליפופוסצין המורכבת ולא במקטעים/קצוות של כל המקטע החיצוני של קולטני האור, מה שיוצר מודל ליפופוסצין שלם ופיזיולוגי יותר. מתוארת כאן שיטה לגרימת הצטברות של חומר דמוי ליפופוסצין (המכונה חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, או UAM) ב- RPE ראשוני טרום לידתי אנושי מובחן מאוד (hfRPE) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הנגזר RPE. UAM הצטבר בתרביות על ידי הזנה חוזרת ונשנית של מקטעי מערכת הפעלה שטופלו באור אולטרה סגול שנקלטו על ידי RPE באמצעות פגוציטוזה. הדרכים העיקריות שבהן UAM מקורב ושונה מ lipofuscin in vivo נדונים גם. בליווי מודל זה של הצטברות דמוית ליפופוסצין, מוצגות שיטות הדמיה להבחנה בין ספקטרום אוטופלואורסצנטי רחב של גרגרי UAM לבין צביעת נוגדנים בו-זמנית. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של UAM על יכולת הפאגוציטוזה של RPE, הוצגה שיטה חדשה לכימות ספיגה ופירוק של מקטע חיצוני. שיטה זו, המכונה "Total Consumptive Capacity", מתגברת על פרשנויות שגויות אפשריות של יכולת פגוציטוזה RPE הטבועה במבחני "מרדף דופק" קלאסיים של המקטע החיצוני. המודלים והטכניקות שהוצגו כאן יכולים לשמש לחקר מסלולי ייצור ופינוי ליפופוסצין ורעילות משוערת.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מספק תמיכה קריטית עבור photoreceptors over, כולל ספיגה יומית והשפלה של קצוות או מקטעים של מקטע חיצוני photoreceptor (לאורך פרוטוקול זה, מערכת ההפעלה קיצור מייצג טיפים או מקטעים של מערכת ההפעלה ולא מקטעים חיצוניים שלמים). ספיגה יומית זו של RPE פוסט-מיטוטי בסופו של דבר מעמיסה על קיבולת פגוליזומלית ומובילה להצטברות של חומר תוך-תאי אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, המכונה ליפופוסצין. באופן מעניין, מספר מחקרים הוכיחו גם כי RPE lipofuscin יכול להצטבר ללא מערכת ההפעלה phagocytosis 1,2. Lipofuscin יש רכיבים רבים, כולל adducts cross-linked נגזר רטינואידים מחזור הראייה, והוא יכול לתפוס כמעט 20%....

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי הכולל רכישה ושימוש ברקמה אנושית נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן (HUM00105486).

1. הכנת קצוות ושברי מקטע חיצוני מחומצן

הערה: רשתיות בקר כהות נרכשו ונשלחו על קרח (ראה טבלת חומרים). מרשתיות אלה, מערכת ההפעלה טוהרה ב?.......

Representative Results

ההגדרה לחמצון תמונות של מערכת ההפעלה מודגמת באיור 1Ai. השקופיות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן מאפשרות טעינה של נפח גדול של מערכת הפעלה בתמיסה לכל מלבן פתוח מבלי להתפשט על פני שאר השקופית. השקופית עם מערכת ההפעלה נמצאת בתוך צלחת פטרי סטרילית כשהמכסה כבוי, ומנורת UV ממוקמת מעל .......

Discussion

בעוד RPE lipofuscin נחקר במשך עשרות שנים, רעילותו שנויה במחלוקת 2,9,16,42. בהינתן עמימות לגבי הרעילות של ליפופוסצין ממודלים של בעלי חיים11, מודלים במבחנה המשתמשים ב- RPE אנושי הם בעלי ערך. מגוון מודלים של הצטברות לי.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת, בחלקה, על ידי מענקים מהקרן לניתוחי זגוגית-רשתית (VRSF), Fight for Sight (FFS) והקרן הבינלאומית לחקר הרשתית (IRRF). J.M.L.M. נתמכת כיום על ידי מענק K08 מהמכון הלאומי לעיניים (EY033420). לא נעשה שימוש בכספים פדרליים למחקר HFT. תמיכה נוספת מגיעה מיוזמת ג'יימס גרוספלד עבור AMD יבש ומהתורמים הפרטיים הבאים: ברברה דאן ודי ודיקסון בראון.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E.

Explore More Articles

194RPEOSAMDUAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved