מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

Abstract

הפאגוציטוזה היומית של המקטעים החיצוניים של קולטני האור על ידי אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תורמת להצטברות פיגמנט הזדקנות תוך תאי המכונה ליפופוסצין. הרעילות של ליפופוסצין מבוססת היטב במחלת סטארגארדט, ניוון הרשתית התורשתי הנפוץ ביותר, אך שנויה יותר במחלוקת בניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך בעולם המפותח. קביעת רעילות ליפופוסצין בבני אדם הייתה קשה, ולמודלים של בעלי חיים של סטארגארדט יש רעילות מוגבלת. לכן, מודלים במבחנה המחקים RPE in vivo אנושי נדרשים כדי להבין טוב יותר את יצירת ליפופוסצין, פינוי ורעילות. רוב המודלים של ליפופוסצין בתרבית תאים עד כה היו בקווי תאים או כללו הזנת RPE ברכיב יחיד של תערובת ליפופוסצין המורכבת ולא במקטעים/קצוות של כל המקטע החיצוני של קולטני האור, מה שיוצר מודל ליפופוסצין שלם ופיזיולוגי יותר. מתוארת כאן שיטה לגרימת הצטברות של חומר דמוי ליפופוסצין (המכונה חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, או UAM) ב- RPE ראשוני טרום לידתי אנושי מובחן מאוד (hfRPE) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הנגזר RPE. UAM הצטבר בתרביות על ידי הזנה חוזרת ונשנית של מקטעי מערכת הפעלה שטופלו באור אולטרה סגול שנקלטו על ידי RPE באמצעות פגוציטוזה. הדרכים העיקריות שבהן UAM מקורב ושונה מ lipofuscin in vivo נדונים גם. בליווי מודל זה של הצטברות דמוית ליפופוסצין, מוצגות שיטות הדמיה להבחנה בין ספקטרום אוטופלואורסצנטי רחב של גרגרי UAM לבין צביעת נוגדנים בו-זמנית. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של UAM על יכולת הפאגוציטוזה של RPE, הוצגה שיטה חדשה לכימות ספיגה ופירוק של מקטע חיצוני. שיטה זו, המכונה "Total Consumptive Capacity", מתגברת על פרשנויות שגויות אפשריות של יכולת פגוציטוזה RPE הטבועה במבחני "מרדף דופק" קלאסיים של המקטע החיצוני. המודלים והטכניקות שהוצגו כאן יכולים לשמש לחקר מסלולי ייצור ופינוי ליפופוסצין ורעילות משוערת.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מספק תמיכה קריטית עבור photoreceptors over, כולל ספיגה יומית והשפלה של קצוות או מקטעים של מקטע חיצוני photoreceptor (לאורך פרוטוקול זה, מערכת ההפעלה קיצור מייצג טיפים או מקטעים של מערכת ההפעלה ולא מקטעים חיצוניים שלמים). ספיגה יומית זו של RPE פוסט-מיטוטי בסופו של דבר מעמיסה על קיבולת פגוליזומלית ומובילה להצטברות של חומר תוך-תאי אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, המכונה ליפופוסצין. באופן מעניין, מספר מחקרים הוכיחו גם כי RPE lipofuscin יכול להצטבר ללא מערכת ההפעלה phagocytosis ^1,2. Lipofuscin יש רכיבים רבים, כולל adducts cross-linked נגזר רטינואידים מחזור הראייה, והוא יכול לתפוס כמעט 20%....

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי הכולל רכישה ושימוש ברקמה אנושית נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן (HUM00105486).

1. הכנת קצוות ושברי מקטע חיצוני מחומצן

הערה: רשתיות בקר כהות נרכשו ונשלחו על קרח (ראה טבלת חומרים). מרשתיות אלה, מערכת ההפעלה טוהרה ב?.......

Discussion

בעוד RPE lipofuscin נחקר במשך עשרות שנים, רעילותו שנויה במחלוקת 2,9,16,42. בהינתן עמימות לגבי הרעילות של ליפופוסצין ממודלים של בעלי חיים¹¹, מודלים במבחנה המשתמשים ב- RPE אנושי הם בעלי ערך. מגוון מודלים של הצטברות לי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000