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この記事について

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要約

このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。

要約

網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、感光体の外側セグメントの先端または断片の毎日の取り込みおよび分解を含む、上にある光受容体に対する重要なサポートを提供する(このプロトコル全体を通して、略語OSは、外側セグメント全体ではなくOSの先端または断片を表す)。有糸分裂後のRPEにおけるこの毎日の取り込みは、最終的に食性ソソーム能力を過負荷にし、リポフスチンと呼ばれる難消化性の自己蛍光性細胞内物質の蓄積につながります。興味深いことに、いくつかの研究はまた、RPEリポフスチンがOS貪食なしに蓄積できることを実証しています1,2。リポフスチンは、視覚周期レチノイドに由来する架橋付加物を含む多くの成分を有しており、80歳以上のRPE細胞体積のほぼ20%を占めることができる3。

リポフスチンが有毒であるかどうかは熱く議論されています。スターガルト病は、光受容体とRPEの常染色体劣性変性であり、ABCA4の変異が光受容体の外側セグメントに含まれる視覚周期レチノイドの不適切な処理を引き起こします。不適切なレチノイド処理は、異常な架橋と、ビス-レチノイドN-レチニリデン-N-レチニルエタノールアミン(A2E)を含むビス-レチノイド種の形成につながります。研究は、A2E毒性の複数のメカニズムを示しています4,5。リポフスチンは臨床イメージング中の眼底自己蛍光シグナルに寄与し、Stargardtの患者と動物モデルの両方が網膜変性の前に眼底自家蛍光の増加を示し、リポフスチンレベルと毒性との相関関係を示唆しています6,7。しかし、年齢とともに、リポフスチンはRPE変性を引き起こすことなくすべての人間に蓄積します。さらに、RPE変性が高齢患者にのみ起こる加齢黄斑変性症(AMD)では、初期および中間型の疾患を有する患者は、年齢を一致させた非疾患のヒトよりも眼底自己蛍光シグナルが少ない8。これらの臨床所見は、組織学的レベルでも検証されています9,10。

RPEリポフスチン蓄積の動物モデルも、リポフスチン毒性についていくつかの曖昧さを残しています。ABCA4ノックアウトマウスは、色素沈着した背景に網膜変性を示しませんが、アルビノの背景または青色光にさらされた場合に現れます11,12。さらに、ABCA4ノックアウトを介して誘導されるリポフスチンの毒性は、AMD13に見られるように、自然な老化に伴って生じるよりゆっくりと蓄積するリポフスチンとは異なる可能性があります。

リポフスチン蓄積のin vitroモデルは、RPEの健康に対するリポフスチン蓄積の影響を研究する代替手段を提供します。このようなモデルは、単一のレチノイド成分の給餌からOSの給餌まで、リポフスチン成分を操作することを可能にし、動物RPEではなくヒトでの研究を可能にする。過去数十年で、培養中のRPEリポフスチンをモデル化するための複数の方法が開発されてきました。他のグループとともに、ボールトン博士のグループは、4〜85歳のドナーからの継代4〜7個のヒト初代RPE細胞で最大3か月間、ウシOSを毎日給餌しました14。あるいは、オートファジーの阻害は、継代3〜7初代ヒトRPE培養物15におけるリポフスチン蓄積ももたらしている。しかし、高度に分化した継代1、初代ヒト出生前RPE(hfRPE)培養における亜致死的リソソーム阻害は、毎日OSを繰り返し添加してもリポフスチンを誘導できなかった16。

より還元主義的なアプローチとして、他の人は単一のリポフスチン成分、特にビスレチノイドA2E 4,17を培養物に与えました。このような研究は、個々のリポフスチン成分に対する毒性の潜在的な直接的なメカニズムを定義するという点で貴重であり、例えば、リソソームコレステロールおよびセラミド恒常性18を示唆する。同時に、A2E19の毒性については議論があり、それを細胞に直接供給することは、光受容体OSの食作用を伴うリポフスチン蓄積の典型的な経路を回避する。リポフスチンの全成分をRPE培養物に送達しようとして、ボールトンおよびマーシャルは、ヒトの目からリポフスチンを精製し、これを胎児および高齢のヒトドナーの両方に由来する継代4〜7ヒト一次RPE培養物に供給した20。この方法は革新的ですが、繰り返し実験するための限られたリポフスチン源を表しています。

RPE培養物へのOSの反復給餌は多くの系でリポフスチンを産生するが、高度に分化した初代RPE培養ではそうしない16。光酸化OSは、生体内のリポフスチン形成中に自然に起こるビスレチノイド形成のような架橋反応を誘導します。これは、高度に分化し、リポフスチン蓄積に耐性を有するものであっても、RPE培養系におけるリポフスチン様顆粒形成を加速することができる16。ここでは、高分化型hfRPEおよびヒトiPSC-RPEにおけるリポフスチン様顆粒蓄積を誘導する方法が紹介され、Wihlmarkの公開プロトコル21から改変される。この方法は、生体内のリポフスチン生成に対して起こるのと同じソース(視細胞OS)および経路(ファゴリソソームOS取り込み)を用いてリポフスチン様顆粒を誘導するという利点を有する。さらに、インビボでヒトRPEを複製するために、高度に分化され、複数の研究で検証されたヒトRPE培養で行われます22、23、24。 これらのリポフスチン様顆粒は、難消化性自己蛍光物質(UAM)と呼ばれ、UAMをin vivoリポフスチンと比較するこのプロトコルのデータと考察を提供します。 高度に分化したヒトRPEにおけるUAMを含む培養物の構築と評価の方法とともに、RPE OSの食作用を評価するための最新の方法も紹介されています。OS食作用を定量化するための複数の優れたパルスチェイス法が導入されており、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、FACS25,26,27などが含まれています。しかし、OSパルスチェイスの早い段階では、OSの取り込み不良につながる条件と、内部化されたOSの急速な劣化を促進する条件が混同される可能性があります。ここで紹介する方法は、RPEによって完全に消費/低下された導入OSの総量(「総消費容量」)を測定し、このあいまいさを排除するのに役立ちます。「総消費容量」法によるOS貪食率への影響など、これらのプロトコルを活用したリポフスチン毒性に関する知見は、生体内でのリポフスチンの毒性を明らかにするために利用されることが期待されます。

プロトコル

ヒト組織の取得と使用を含む本プロトコルは、ミシガン大学治験審査委員会(HUM00105486)によってレビューおよび承認されました。

1. 光酸化アウターセグメントチップおよびフラグメントの調製

注:暗順応したウシ網膜を購入し、氷上で出荷しました( 材料の表を参照)。これらの網膜から、OSは、以前に公開されたプロトコル23に従って精製された。

  1. UVランプによるアウターセグメント架橋
    1. ポリテトラフルオロエチレンでコーティングされたスライド( 材料の表を参照)を70%エタノールに完全に浸し、バイオセーフティキャビネットに10分間浸して、スライドを滅菌します。スライドを滅菌済みの100 mm細胞培養皿で風乾します。
    2. 各スライドを1つの新しい100 mm細胞培養皿に入れ、200 μLの血清含有細胞培養培地(手元のRPE培養に通常使用される培地)を各長方形に追加し、次にハンドヘルド254 nmUV光(材料の表を参照)をバルブをスライドに直接向けた100 mm細胞培養皿(蓋なし)に置きます。 そして20分間露光します。この研究に特に使用された培地および培地の構成要素の特定の製品番号は、以前に公開されている22,23。このメディアは、このプロトコル全体で「RPEメディア」と呼ばれます。
      メモ: メディアの UV 処理はガラス表面をブロックし、次の手順で OS がくっつくのを防ぎます。
    3. 凍結したOSアリコートを37°Cで解凍します(手または水浴 を介して )。必要な OS の量は、アプリケーションによって異なります。一般に、スライド上の長方形あたり最大500 μLの2 x 108 OS/mLを処理できます。
    4. 解凍したら、OSを2400 x g で室温で5分間回転させます。ペレットの偶発的な損失を防ぐために、真空ではなくピペットを使用してバイオセーフティキャビネット内の上清を直ちに吸引します。
    5. ペレットを滅菌PBSで静かに再懸濁します。
      注意: 再懸濁された量と予想される濃度を追跡します。例えば、1 x 10 8 OS/mLの1 mLチューブから500 μL PBSでペレットを再懸濁すると、2 x 108 OS/mLが得られます。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライド上の長方形あたりの最大容量と濃度は、2 x 108 OS/mLの500 μLです。
    6. スライドから培地を吸引し、スライドの各長方形に最大500 μLの2 x 108 OS/mL PBS溶液を置きます。ハンドヘルドUVライトを細胞培養皿(蓋なし)の上に置き、電球をOSに直接向けます。 OS溶液を254nmの光に40分間さらします。
      注意: 40分間の暴露中は、UVランプと皿をタオルまたは吸収パッドで覆い、バイオセーフティキャビネットサッシを閉じて、ブロワーをオフにします。これにより、大幅な蒸発を防ぐことができます。このプロトコルで使用されているUVランプが研究者に利用できない場合、適切な量の架橋を確実に達成するための2つの選択肢があります。1つ目は、ステップ1.2で概説したデバイス、または1.2で前記デバイスと同じ定量的放射曝露を提供できる別のデバイスのいずれかを使用して、ステップ1.2で概説した定量的UV曝露に従うことです。別の代替案は、 図1Cに見られるクマシー染色の架橋の程度を誘発する時間、OSをUV照射にさらすことである。
    7. 処理したOS PBS溶液を滅菌マイクロ遠心チューブに集め、コーティングされたスライドの長方形を200〜500μLのPBS(2〜3x)で再洗浄し、各洗浄をマイクロ遠心チューブに回収します。完了したら、組織培養室の顕微鏡でスライドを見て、ほぼすべてのOSがスライドから削除されていることを確認します。
    8. OS PBS溶液を室温で2400 x g で5分間スピンダウンし、バイオセーフティキャビネット内のPBSをピペッターで吸引し、RPE培養に使用される500 μLの標準培地(例:セクション1.1.2で定義された「RPE培地」)に再懸濁します。再懸濁量は、所望の光酸化OS(OxOS)濃度に基づいて調整することができる。
    9. 10 μLの懸濁液を新しい微量遠心チューブに入れ、より多くの細胞培養培地で50〜100倍に希釈し、血球計算盤でOSをカウントします。
    10. OS数に基づいて、OxOSサスペンションを最終的なストック濃度に希釈します。24ウェルトランスウェル(表面積0.33 cm 2;材料表を参照)で高度に成熟したRPE培養物を供給する場合、2 x 107 OS/mLの最終培地濃度が推奨されます。
      1. これを達成するには、OxOSを5.6 x 107 OS/mL濃度で25 μLアリコートに分配し、標準的なRPE培地に懸濁します。25 μLのアリコートを解凍した後、アリコート全体を45 μLの標準RPE培地と混合し、OxOSトランスウェル供給ごとに70 μLの最終培地容量と2 x 107 OS/mLのOS濃度を提供します。
    11. OxOSを分注する前に、OSの取り込みとリポフスチンの蓄積を促進する食作用ブリッジリガンド(プロテインSおよびMFG-E8、 材料の表を参照)を追加します。24ウェルトランスウェル中の架橋リガンドの使用濃度は、ヒト精製プロテインSで4 μg/mL、ヒト組換えMFG-E8で1.5 μg/mLです。したがって、5.6 x 107 OS/mLで25 μLのOxOSアリコートの場合、プロテインSのストック濃度は11.2 μg/mLであり、MFG-E8のストック濃度は4.2 μg/mLです。
      注:ブリッジリガンド濃度は、24ウェルトランスウェルでのhfRPE培養用に最適化されており、細胞数は0.33 cm2 ウェルあたり約320,000細胞でした。食作用受容体の利用可能性を超えて存在するリガンドは逆説的にOSの取り込みを遮断する可能性があるため、リガンド濃度は他のRPEタイプおよび細胞密度に対して調整する必要があるかもしれない28。
    12. 液体窒素中のアリコートをスナップ凍結します。
      メモ: 複数回のフリーズ解凍は、OS の整合性に非常に悪影響を及ぼします。
  2. UV架橋剤装置によるアウターセグメント架橋
    メモ: 手順 1.1.2 と 1.1.6 をそれぞれ置き換える以下の手順を除き、手順 1.1 に従います。
    1. (手順 1.1.2 を置き換えます)各スライドを1つの新しい100 mm細胞培養皿に入れ、200 μLの血清含有細胞培養培地(例:「RPE培地」またはその他の代替品)を各長方形に追加し、スライドを紫外線架橋剤デバイス( 材料の表を参照)に入れ、3〜6 J / cm2 の放射露光で254 nmのUVで処理して、ガラス表面をブロックし、次のステップでのOSの固着を防ぎます。
    2. (ステップ1.1.6を置き換えます)スライドから培地を吸引し、スライドの各長方形に滅菌PBS中の2 x 108 OS/mLを最大500 μL入れます。スライドを紫外線架橋剤装置に入れ、必要に応じて治療放射露出(3-9 J/cm2)を設定し、254 nmで処理します。
      注:必要な放射曝露は、自家蛍光の程度まで3〜9 J / cm2の間で放射曝露を滴定し、タンパク質架橋(図1Bおよび図1Cに見られるように)を達成することによって慎重に決定できます。
      注意: バイオセーフティキャビネットの外でOSを取り扱うと、汚染が発生する可能性があります。OSをUV架橋装置にさらした後、滅菌ピペットチップでOSを収集し、滅菌マイクロ遠心チューブに移し、バイオセーフティフードで以降のすべてのステップを処理します。
  3. 酸化OSのキャラクタリゼーション
    1. イメージングによる自家蛍光発光スペクトルの定量化
      1. 未処理のOSとOxOSからの20〜50μLのストック溶液を2つの別々のマイクロ遠心チューブに入れます。室温で2400 x g で5分間遠心分離し、ペレットを緩衝(PBSなど)4%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、室温で15分間固定します。
      2. 固定後、上記のようにスピンダウンし、PBS x 2で洗浄し(洗浄の合間にスピンダウン)、30 μL未満のPBSに再懸濁します。
      3. 数マイクロリットルの再懸濁液を顕微鏡スライドに置き、封入剤( 材料表を参照)を追加し、最後にカバーガラスを追加します。
      4. 共焦点顕微鏡での画像OxOS( 材料表を参照)。
        注:OxOSの自家蛍光は、広範囲のレーザー波長で励起できますが、通常は405nmまたは488nmのレーザーラインが使用されます。発光も同様に広いですが、自家蛍光を見るには、典型的なGFP/FITC励起/発光フィルターのセットアップで十分です。
      5. OxOS発光スペクトルを測定するには、共焦点顕微鏡でλスキャンを使用します。典型的なλスキャン設定には、405 nmまたは488 nmでの励起、およびレーザー励起ラインから赤方偏移した10 nmから約800 nmまでの範囲の発光の検出が含まれ、λステップサイズは10 nmです。各顕微鏡システムには、λモードの採用方法に関する独自の指示があり、読者は特定の共焦点のマニュアルを参照する必要があります。
    2. 別の方法として、フローサイトメトリーによって自家蛍光を定量します。
      1. 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンし、1 mLのPBSに再懸濁します。
        注:解凍直後にフローサイトメトリーを行う場合、固定は必要ありません。
      2. 未処理のOSおよびOxOSサンプルをフローサイトメーターにロードします( 材料表を参照)。前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)をFSC-SSC散布図の許容可能な広がりに調整します。PBSをコントロールとして使用して、汚染された小さな粒子を除外します。OSはセルよりもかなり小さいことに注意してください。
      3. フローサイトメーターの標準FITCチャンネルを使用して、自己蛍光定量を行います。少なくとも 10,000 件のイベントをカウントします。FITCヒストグラムのパルス面積値を使用して、蛍光強度を表します。
        注:本研究では、すべてのデータは、製造元の指示に従って、フローサイトメーター分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して分析されます。
    3. OxOSにおける架橋の程度を評価する
      1. 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンします。上清を除去し、1.2倍のLaemmliサンプルバッファーを加えてペレットを直接溶解します(カバーするのに十分です;材料の表を参照)。ボルテックス、室温で30分間保持し、室温で12000×g以上で10分間スピンダウンし、上清を回収する。
        注:OxOSにおけるタンパク質架橋の程度を評価すると、UV処理の妥当性がわかります。未処理のOSとOxOSを比較し、クーマシー染色を支配する単量体ロドプシンバンド(図1C、矢印)が知覚できるだけで、ゲルの上部に高次凝集体とタンパク質塗抹標本が出現すると、適切な架橋が発生します。
        注意: サンプルバッファーを使用してOSを溶解する場合は、ロドプシン凝集を引き起こす可能性があるため、その後溶解溶液を加熱しないでください。また、SDSを沈殿させるため、保存の準備ができるまで溶解したOSを冷却することは避けてください。未使用のライセートは-20°Cに保つことができます。 リサリングする場合は、ライセートが室温で完全に解凍されていることを確認してから使用してください。
      2. 高いSDSおよび還元剤濃度に耐性のあるタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を定量します29。適切なタンパク質アッセイ試薬に関する提案については、 材料表 を参照し、これらの試薬の製造元のプロトコルに従ってください。
      3. 標準トリスグリシンSDSバッファーを使用して、4%〜15%のグラジエントゲル上でSDS-PAGE電気泳動30 によって未処理のOSおよびOxOSサンプルを実行します。ゲルは、サンプルがスタックに入るまで80 Vで実行され、次に室温で50〜60分間120 Vで実行されます。
      4. 標準プロトコル31を使用して、ゲルをクマシーブルーで染色します。クーマシー染色は、UV処理によって誘発される架橋の妥当性を実証します。

2. RPE培養におけるリポフスチン様顆粒(UAM)の構築

  1. OxOSフィード:量、頻度、および食作用ブリッジングリガンド
    注:摂食は、継代1のヒトiPSC-RPEまたはhfRPE培養で行われ、Bhartiラボ(iPSC-RPEの場合)32によって概説されたプロトコルまたはシェルドンミラーラボ22,23から適応されたhfRPEの以前に概説されたプロトコルに従って増殖します。以下のすべての計算は、OxOSまたはOSを1つの24ウェルトランスウェル(直径6.5 mm、成長面積0.33 cm2)に供給することに基づいています。
    1. 25 μLの5.6 x 107 OxOS/mLを37°Cで解凍し、45 μLの細胞培養培地をOxOSアリコートに加えると、最終容量は70 μLになります。
      注:ステップ1で調製したOxOSアリコートには、食作用架橋リガンドMFG-E8およびプロテインSが含まれます。ただし、これらのリガンドが凍結前にアリコートに添加されていない場合は、このステップで添加することができ、細胞に供給される培地中のリガンドの最終濃度がプロテインSで4 μg/mL、MFG-E8で1.5 μg/mLになるようにします。ステップ1.1.11で述べたように、ブリッジリガンドの濃度は、他のRPEタイプまたは細胞密度に合わせて変更する必要があるかもしれません。
    2. Transwellから頂端培地を除去し、貪食ブリッジリガンドを頂端チャンバーに結合する2 x 107 OxOS/mLを70 μL加えます。24時間後、取り外して新しいOxOSフィードと交換します。給餌は、週末を除いて、20回の給餌が完了するまで(~1か月)平日は毎日行われます。基底外側細胞培養培地(400-550 μL)を2〜3回/週に交換します。
    3. 20回の給餌が完了したら、ウェルの通常の培地交換を再開します。
      注:RPE頂端表面から粘着性のあるOxOSを洗い流すには、さらにいくつかの培地交換が必要なため、UAMを含む培養物の実験は、OxOSフィードが終了してから少なくとも1〜2週間後に行う必要があります。
      注意: OxOS フィードを介した UAM の蓄積を適切に制御することが重要です。毎日の培地交換はRPE生物学に影響を与える可能性があるため、以下のコントロールウェルが推奨されます:コントロール1:OxOS処理群と同じ数の給餌のために、平日は毎日培地を交換してください。対照2:RPE未処理OSを平日、OxOS給餌と同じ濃度と量で、同じ給餌回数で毎日給餌する。
  2. 経上皮電気抵抗(TEER)および細胞死アッセイによるリポフスチン様顆粒を含む培養物の健康状態のモニタリング
    注:OxOSの供給中および給餌後のRPE培養の健全性は、RPEタイトジャンクションの完全性と細胞死を評価することによって測定できます。経上皮電気抵抗(TEER)の測定によるタイトジャンクションの完全性の評価は、一般的な細胞の健康の敏感なマーカーであることが以前に示されています33。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出など、より伝統的な細胞死の非侵襲的マーカーも採用できます。
    1. ティアを実行する
      注意: TEERは、経上皮電気抵抗(TEER)メーターとTEAR電極でテストされ、通常は製造元の指示に従ってテストされます( 材料表を参照)。
      1. TEER電極を滅菌するには、70%エタノールに浸したタスクワイパーを使用して電極を洗浄し、電極プローブの先端を70%エタノールに10分間浸します。
      2. 電極を完全に乾燥させてから、電極を滅菌培地に浸します。
      3. 滅菌培地からプローブを取り出し、TEAR電極の2つのプローブを培養トランスウェルの頂端チャンバーと基底外側チャンバーに挿入します。長いプローブチップは基底外側チャンバーに収まります。
        注:練習せずにTEER電極で頂端チャンバーの底部をこするのは簡単で、そのような掻き取りは、コンフルエントなRPE単層が破壊されると、TEARの読み取り値が劇的に変化します。したがって、初心者は、実験的なRPE培養でテストする前に、重要でないトランスウェルで練習することをお勧めします。さらに、RPE培養の各プレートがテストされた後、実験者は、標準的な組織培養顕微鏡下でRPE単層の掻き取りを確認する必要があります。
      4. 頂端プローブと基底外側プローブがトランスウェルに配置されたら、 読み取り ボタンを押すか、メーターのフットスイッチを踏んでTEERを記録します。プレートまたはセル群の間で、電極プローブを滅菌培地で洗浄します。感染が懸念される場合は、プレート間で再滅菌してください。
      5. メーターから抵抗の読み取り値を取得し、培地を含むがセルがない空白のトランスウェルの値(表面積が0.33cm2 の24ウェルトランスウェルの場合は通常100〜110 Ω)を差し引き、トランスウェルの表面積を掛けてTEARを計算します。
        注:TEER値は、細胞表面積に正規化して報告する必要があります。健康なhfRPE培養の典型的な値は350〜1100Ωcm2の範囲です。TEER値は温度が下がると増加します。したがって、培養物を37°Cのインキュベーターから室温のフードに移すと、TEER値はプレート全体で増加する傾向があります。この変動を防ぐには、迅速に作業するか(経験がある場合)、プレート温度が室温と平衡になるまで10〜15分待ちます。
    2. LDH放出アッセイの実行
      注:細胞培養上清へのLDHの放出は細胞死中に発生し、標準キットで測定されます(材料の表を参照)。
      1. 24時間のインキュベーション後に細胞の上から上清を収集し、標準培地を使用して1:100に希釈します。
      2. 24ウェルトランスウェルのコントロール細胞から100 μLの頂端培地に2 μL 10%トリトンX-100を添加することにより、ステップ2.2.2.1のすべての値を正規化するために重要な、可能な総LDH放出を誘導します。トリトン/細胞上清混合物を37°Cで15分間インキュベートした後、溶解した細胞の上に培地を混合して回収し、可能な総LDH放出を測定します。
      3. 上清を回収したら、メーカーの標準的な説明書を使用してアッセイを実行し、キットの緩衝液を使用して30分間インキュベートした後に発光を測定します。
        注:すべてのLDH値は、LDH放出の可能な合計量に正規化されています。
  3. リポフスチン様顆粒スペクトルおよび組成の特性評価
    1. 自家蛍光定量とスペクトルの取得
      1. UAMを含む培養物を4%PFAで室温で15分間固定し、続いてPBSで5回洗浄します。
      2. 頂端室に少量のPBSを保管してから、トランスウェルを逆さまにします。解剖顕微鏡とかみそりの刃を使用して、トランスウェルから半多孔膜を切り取り、膜とトランスウェルの接合部に切削力を加えます。
        注意: トランスウェル膜は、カットが一貫していないときに反ったりしわになったりする傾向があるため、カットが行われるトランスウェルの唇にどれだけ近いかについて一貫性を保ちます。
      3. トランスウェルメンブレンを切断したら、すぐに鉗子を使用して顕微鏡スライドの上に置き、トランスウェルメンブレンの一部に細胞に触れないように注意してください。細胞に触れないようにしながら、タスクワイプで余分なPBSを吸い取ります。マウントメディアとカバーガラスを追加します。トランスウェルをカバースリップするときは、トランスウェルのどちら側が「右側を上に」しているかを追跡してください。
      4. ステップ1.3.1.4およびステップ1.3.1.5と同じ設定と手順で自己蛍光強度とスペクトルを取得します。
        注:UAMをイメージングする場合、重要な交絡因子は、OxOSが自己蛍光性であり、OxOSフィードの完了後数日、場合によっては数週間もRPE頂端表面に付着することが多いことです。その結果、UAMを定量する場合、測定された自家蛍光がOxOSではなくUAMから来ていることを確認する方法を採用する必要があります。最も簡単な方法は、リポフスチン培養物をロドプシン抗体と共染色することです。例えば、抗ロドプシン抗体4D2は、1:1000の希釈率で、標準的なPFA固定免疫細胞化学プロトコル34と共に使用することができる。ロドプシンの二次抗体は、UAMおよびOxOSの自己蛍光がこの波長で最も弱い傾向があるため、遠赤色色素結合抗体(例えば、647 nm付近に励起極大を有する)である必要があります。その後、共焦点画像を2つのチャネルで順次取得でき、UAMとOxOSの自家蛍光を405 nmレーザーで励起し、415 nmから550 nmの発光を励起し、未消化のOxOSを示す残留ロドプシンは、別のチャネルで標準的な遠赤色色素イメージングパラメーターで励起できます。取得後、ロドプシンチャネルをImageJのようなプログラムでサブトラクティブマスクとして使用して、粘着性のある残りのOxOSから来る自家蛍光を除去し、UAM自家蛍光だけを残して定量することができます。
        注意:光酸化されていないOSでもある程度の自家蛍光を示し、厳密な洗浄を行っても、一部のOSおよびOxOSはRPE表面に付着します。したがって、ロドプシン免疫染色を用いてサブトラクティブマスクを生成しなければ、上記の注で示唆されているように、OxOまたは標準OSを給餌した培養物におけるUAM自己蛍光レベルの正確な定量は不可能である。
    2. リポフスチン様顆粒と他の免疫蛍光マーカーの同時検出
      注:ステップ2.3.1で詳述されているように、リポフスチンの広い自己蛍光スペクトルは、蛍光共染色の選択肢を制限します。共染色を容易にするために、以下の方法が考えられる。
      1. 遠赤色蛍光色素を使用します。リポフスチンからの自家蛍光は近赤外線では弱い。したがって、目的の抗原の蛍光検出に遠赤色色素を使用し、共焦点顕微鏡上でのチャネル設定の慎重な調整と組み合わせることで、通常、自家蛍光と共染色蛍光を区別することができます。
      2. リポフスチンの長い蛍光発光テールを活用しましょう。
        注:リポフスチンは非常に広い蛍光発光スペクトルを持っているため、低nm波長(例:405 nmレーザー)で励起され、スペクトルのオレンジ/赤色部分(例:585-635nm)で発光が検出されることがよくあります。励起波長と発光波長のこのユニークな組み合わせは、多くの場合、別の共染色蛍光色素を中心に調整できます。
        1. 488 nm付近にピーク励起を持つ蛍光色素を使用して目的の抗原を検出し、500-530 nmで発光を検出します。405 nmの励起と585-635 nmの発光による自己蛍光検出用に別のチャンネルを設定します。この2番目のチャネルはUAMのみを検出し、最初のチャネルは目的の抗原とリポフスチンを検出します。
        2. ImageJのようなフリーウェアプログラムを使用して、この2番目のUAM専用チャネルを減算マスクとして使用して、最初のチャネル(抗原信号とUAM信号の両方を含む)からUAM信号を削除します。
      3. スペクトルアンミキシングを利用します。最新の共焦点顕微鏡のほとんどには、スペクトルアンミキシングオプションが含まれています。これにより、UAMのみでサンプルのスペクトルを取得し、目的の共染色蛍光色素のみで別のサンプルのスペクトルを取得できます。次に、UAMと共染色蛍光色素の両方を含む実験サンプルを取得し、線形アンミキシング法にかけ、シグナルの何パーセントが自家蛍光によるものと共染色によるものかを計算できます。
        注:スペクトルアンミキシングの包括的なガイドは、最新の共焦点顕微鏡で入手できます。
      4. 蛍光寿命イメージングを活用します。UAMと目的の共染色蛍光色素の発光スペクトルは類似しているかもしれませんが、蛍光寿命は大きく異なる可能性があります。一般に、UAMは、ほとんどの特異的蛍光色素よりも短い蛍光寿命を示します。生涯イメージングを可能にする共焦点顕微鏡へのアクセスにより、蛍光シグナルをゲートして、典型的なリポフスチンの寿命よりも長いシグナルを検出することができます。
        注:一般に、蛍光寿命を2nsより長い信号にゲーティングすると、UAM汚染が大幅に減少しますが、シグナルが完全になくなるわけではありません。
      5. 自家蛍光抑制剤の利用。伝統的に、スーダンブラックは、特異的免疫蛍光染色の前に自家蛍光を消光するために使用されてきた35。いくつかの市販の自家蛍光消光剤製品は、スーダンブラックの結果を改善することを報告しており、これらの製品は 材料表に詳述されています。もちろん、自己蛍光消光はリポフスチンを検出する能力を破壊します。
    3. リポフスチン様顆粒の組成を決定する
      1. 中性脂質の評価
        1. UAMを含んだRPEとコントロールウェル(未処理のOSを供給)を4%PFAに室温で15分間固定し、PBSで5回洗浄します。
        2. 10 μg/mL ナイルレッドまたは3.33 μg/mL Bodipy 493/503を3%BSA PBS溶液中で室温で1時間使用し、続いてPBSで5分間3回洗浄した後、中性脂質を染色します。
        3. 手順2.3.1.2および2.3.1.3と同様にTranswellを切り取って取り付け、画像を作成します。一般に、イメージングには、ナイルレッド-ex543 nm、em 620-700 nmおよびボディ493/503-ex488 nm、em 500-550 nmの励起帯域幅と発光帯域幅を使用します。
      2. エステル化コレステロールと非エステル化コレステロールの評価
        1. ステップ 2.3.3.1.1 に従います。
        2. フィリピンは、エステル化されていないコレステロールを認識する蛍光染料ですが、エステル化コレステロールは認識しません36。したがって、UAM中の総コレステロール(エステル化されていないおよびエステル化)の量を評価するために、最初にサンプルをコレステロールエステラーゼで前処理して、エステル化コレステロールをエステル化されていないコレステロールに変換します。細胞を0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)中の20 U/mLコレステロールエステラーゼ( 材料の表を参照)で37°Cで3.5時間処理した後、PBSで5分間3回洗浄します。
        3. PBS中の50 μg/mLフィリピン( 材料の表を参照)で室温で1時間染色し、PBSで5分間3回洗浄します。フィリピンの光退色しやすいため、サンプルを光から遠ざけてカバーしてください。
          注:エステル化されていないコレステロールのみを定量する場合は、ステップ2.3.3.2.2のコレステロールエステラーゼをスキップできます。エステル化コレステロールの量が定量されるべきである場合、試料中の総コレステロールと非エステル化コレステロールとの差によって推定することができる。
        4. 手順2.3.1.2および2.3.1.3と同様にTranswellを切り取って取り付け、イメージします。
          注:フィリピンを画像化すると、非常に速く光退色します。励起の強度と持続時間を最小限に抑える必要があり、接眼レンズを通してサンプルを見ると、いくらかの光退色が発生する可能性があると予想する必要があります。したがって、イメージングの際には、(1)フィリピンチャネル以外の蛍光チャンネルを用いてイメージングに適した領域を探索し、(2)共焦点顕微鏡ではなく広視野顕微鏡でフィリピンを撮像し(光露光の強度を制限するため)、(3)領域の繰り返しイメージングを避けるべきである。一般に、フィリピンのイメージングには以下の励起および発光帯域幅を使用する−ex380nm、em480nm。

3. RPE食作用に対するリポフスチン様顆粒の効果の評価:総消費能力

注:以下のOSパルスのみのプロトコルを介してOSの食作用を測定する理論的根拠は、代表的な結果のセクションで詳しく説明されています。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来のOSパルスチェイス食作用アッセイで発生する可能性のある食作用効率に関するあいまいさを回避します。アッセイは、4 x 106 OS/mLを含む50 μLの培地を使用して、24ウェルトランスウェルプレート上で行われます。

  1. 実験に必要なウェル数を計算し、適量の通常のOSを解凍し、室温で2400 x g で5分間スピンダウンし、標準のRPE細胞培養培地で4 x 106 OS/mLに再懸濁します。ブリッジリガンドを追加して、食作用速度を促進します。
    注:細胞に供給される培地中の架橋リガンドの最終濃度は、プロテインSで4 μg/mL、MFG-E8で1.5 μg/mLです。ステップ1.1.11で述べたように、ブリッジリガンドの濃度は、他のRPEタイプまたは細胞密度に合わせて変更する必要があるかもしれません。
  2. 頂端培地を除去し、理想的には適切な濃度の架橋リガンドとともに50 μL 4 x 106 OS/mLを加えます。
  3. OS添加後のさまざまな時点(例:0時間、1時間、4時間、24時間)に、プロテアーゼ阻害剤を含む16.67 μL 4x Laemmliサンプルバッファーを加えて、細胞とその上にあるOS含有上清の両方を溶解します。P-200ピペットを使用してトランスウェル表面を傷つけ、トランスウェルメンブレンに穴を開けたり、メンブレンをトランスウェルから剥離したりしないように注意し、細胞上清と細胞ライセートを一緒に収集します。ボルテックス、スピンダウンし、室温で30分間放置して完全に変性させます。
    注意:サンプルバッファーを使用してOSを溶解する場合でも、ロドプシン凝集を引き起こす可能性があるため、その後溶解溶液を加熱しないでください。また、保存の準備ができるまで溶解したOSを冷却するとタンパク質が沈殿するため、避けてください。未使用のライセートを-20°Cで凍結し、ライセートが完全に解凍されていることを確認してから使用してください。
  4. ステップ 1.3.3 と同じ設定を使用して SDS PAGE でライセートを実行し、ウェルごとに同量のライセートをロードします。食作用率は細胞数に依存するため、GAPDH、βアクチン、または別のハウスキーピングタンパク質を使用して細胞数を正規化する必要があります。
  5. ロドプシンのN末端またはC末端に対する抗体でウェスタンブロットをプローブします。標準的なウェスタンブロッティング条件を使用し、抗体希釈は 材料表に記載されています。
    注:メインのロドプシンバンドの下には、複数のロドプシンフラグメントがあります。これらの断片は、部分的に消化されたロドプシンを表し、ファゴソームとリソソームとの融合の前に開始されるプロセス32,33。対照RPEと比較したUAM含有RPEにおけるロドプシンフラグメントの数の増加は、ファゴソーム-リソソーム融合、リソソーム酸性化、および/または分解酵素機能のレベルで、ファゴリソソーム容量の下流の欠陥を示している可能性があります16,34,35。

結果

OSの光酸化のセットアップを図1Aiに示します。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライドにより、スライドの残りの部分に広がることなく、開いた長方形ごとに大量の溶液中のOSをロードできます。OS付きのスライドは、蓋を外した滅菌ペトリ皿内に含まれ、図1Aiiに示すようにUVランプがスライドの上に置かれます。あるいは、スラ?...

ディスカッション

RPEリポフスチンは何十年にもわたって研究されてきましたが、その毒性は議論されています2,9,16,42。動物モデル11からのリポフスチンの毒性についての曖昧さを考えると、ヒトRPEを用いたin vitroモデルは貴重です。さまざまなin vitroリポフスチン蓄積モデルが記載さ?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、硝子体網膜外科財団(VRSF)、ファイト・フォー・サイト(FFS)、および国際網膜研究財団(IRRF)からの助成金によって部分的にサポートされています。J.M.L.M.は現在、国立眼科研究所からのK08助成金(EY033420)によってサポートされています。HFTの研究に連邦資金は使用されていません。さらなる支援は、Dry AMDのためのJames Grosfeld Initiativeと、次の民間ドナーであるBarbara DunnとDee & Dickson Brownからのものです。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

参考文献

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