高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。