이 작업은 유리체-망막 수술 재단(VRSF), 시력을 위한 싸움(FFS) 및 국제 망막 연구 재단(IRRF)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 현재 국립 안과 연구소(National Eye Institute, EY033420)의 K08 보조금으로 지원되고 있습니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry AMD)와 바바라 던(Barbara Dunn), 디 앤 딕슨 브라운(Dee & Dickson Brown)의 개인 기부자들의 지원이 더욱 지원된다.

인체 조직의 획득 및 사용과 관련된 현재 프로토콜은 University of Michigan Institutional Review Board(HUM00105486)에 의해 검토 및 승인되었습니다.
1. 광산화된 외측 세그먼트 팁 및 단편의 제조
참고: 어둠에 적응한 소 망막은 구입하여 얼음 위에서 배송했습니다( 재료 표 참조). 이들 망막으로부터, OS는 이전에 공개된 프로토콜23에 따라 ?...

망막 색소 상피 식세포작용 및 리포푸신 축적 정량화

RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델11에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공?...

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다3.
리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노이드 종의 비정상적인 가교 결합 및 형성을 초래합니다. 연구는 A2E 독성에 대한 여러 메커니즘을 입증했습니다 4,5. 리포푸신은 임상 영상 촬영 중 안저 자가형광 신호에 기여하며, Stargardt의 환자와 동물 모델 모두 망막 변성 전에 증가된 안저 자가형광을 나타내며, 이는 리포푸신 수치와 독성 사이의 상관관계를 시사합니다 6,7. 그러나 나이가 들어감에 따라 리포푸신은 RPE 퇴행을 유발하지 않고 모든 인간에게 축적됩니다. 또한, RPE 변성이 노인 환자에서만 발생하는 연령 관련 황반변성(AMD)의 경우, 초기 및 중간 형태의 황반변성을 가진 사람들은 연령이 일치하지 않는 사람보다 안저 자가형광 신호가 적다8. 이러한 임상 소견은 조직학적 수준에서도 검증되었습니다 9,10.
RPE 리포푸신 축적의 동물 모델은 또한 리포푸신 독성에 대해 약간의 모호성을 남겼습니다. ABCA4 녹아웃 마우스는 착색된 배경에서는 망막 변성을 나타내지 않는 반면, 알비노 배경에서는 또는 청색광에 노출될 때 나타납니다11,12. 또한, ABCA4 녹아웃을 통해 유도된 리포푸신의 독성은 AMD13에서 볼 수 있듯이 자연 노화와 함께 발생하는 더 천천히 축적되는 리포푸신과 다를 수 있습니다.
리포푸신 축적의 시험관 내 모델은 리포푸신 축적이 RPE 건강에 미치는 영향을 연구하는 대안을 제공합니다. 이러한 모델은 단일 레티노이드 성분 공급에서 OS 공급에 이르기까지 리포푸신 성분을 조작할 수 있게 하고 동물 RPE가 아닌 인간에서 연구할 수 있도록 합니다. 지난 수십 년 동안 배양에서 RPE 리포푸신을 모델링하기 위해 여러 방법이 개발되었습니다. 다른 그룹과 함께, Boulton 박사의 그룹은 4세에서 85세 사이의 기증자로부터 4-7개의 인간 일차 RPE 세포를 통과하여 최대 3개월 동안 매일 소 OS를 공급했습니다14. 대안적으로, 자가포식의 억제는 또한 계대 3 내지 7 일차 인간 RPE 배양물에서 리포푸신 축적을 유도하였다15. 그러나, 고도로 분화된 계대 1, 1차 인간 산전 RPE(hfRPE) 배양물에서 치사율 이하의 리소좀 억제는 매일 OS를 반복적으로 첨가했음에도 불구하고 리포푸신을 유도하는 데 실패했다16.
보다 환원주의적인 접근 방식으로, 다른 사람들은 단일 리포푸신 성분, 특히 비스-레티노이드 A2E 4,17을 배양물에 공급했습니다. 이러한 연구는 리소좀 콜레스테롤과 세라마이드 항상성 등을 내포하는 개별 리포푸신 성분에 대한 잠재적인 직접적인 독성 기전을 정의한다는 점에서 가치가 있다18. 동시에, A2E19의 독성에 대한 논쟁이 있으며, 이를 세포에 직접 공급하는 것은 광수용체 OS의 식균 작용을 포함하는 리포푸신 축적의 전형적인 경로를 우회합니다. 리포푸신의 모든 성분을 RPE 배양물에 전달하기 위한 시도로, Boulton과 Marshall은 인간의 눈에서 리포푸신을 정제하여 태아 및 노인 인간 공여자로부터 유래한 인간 일차 RPE 배양물 4-7계대에 공급하였다20. 혁신적이기는 하지만 이 방법은 반복 실험을 위한 제한된 리포푸신 공급원을 나타냅니다.
RPE 배양에 OS를 반복적으로 공급하면 많은 시스템에서 리포푸신이 생성되지만, 고도로 분화된 1차 RPE 배양에서는 리포푸신이 생성되지 않습니다16. 광산화 OS는 생체 내에서 리포푸신 형성 중에 자연적으로 발생하는 비스-레티노이드 형성과 같은 가교 반응을 유도합니다. 이는 RPE 배양 시스템에서 리포푸신 유사 과립 형성을 가속화할 수 있으며, 심지어 고도로 분화되고 리포푸신 축적에 내성이 있는 시스템에서도 가속화될 수 있다16. 여기서, 고도로 분화된 hfRPE 및 인간 iPSC-RPE에서 리포푸신 유사 과립 축적을 유도하는 방법이 도입되며, 이는 Wihlmark의 공개된 프로토콜21에서 변형됩니다. 이 방법은 생체 내에서 리포푸시노생성에 대해 발생하는 것과 동일한 공급원(광수용체 OS) 및 경로(phagolysososomal OS 흡수)를 사용하여 리포푸신 유사 과립을 유도하는 이점이 있습니다. 또한, 생체 내에서 인간 RPE를 복제하기 위해 여러 연구에서 고도로 차별화되고 검증된 인간 RPE 배양에서 수행됩니다 22,23,24. 이러한 리포푸신 유사 과립은 소화되지 않는 자가형광 물질(UAM)이라고 하며, 이 프로토콜에서 UAM을 생체 내 리포푸신과 비교하는 데이터 및 논의를 제공합니다. 고도로 분화된 인간 RPE에서 UAM이 함유된 배양을 구축하고 평가하는 방법과 함께 RPE OS 식균 작용을 평가하는 업데이트된 방법도 도입되었습니다. 웨스턴 블로팅, 면역세포화학 및 FACS25,26,27을 포함하여 OS 식균 작용을 정량화하기 위한 여러 가지 우수한 펄스 추적 방법이 도입되었습니다. 그러나 OS 펄스 추적 초기에는 OS 활용률이 저하되는 조건이 내재화된 OS의 급격한 성능 저하를 촉진하는 조건과 혼동될 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 RPE에 의해 완전히 사용/저하된 도입된 OS의 총량("총 소비 용량")을 측정하여 이러한 모호성을 제거하는 데 도움이 됩니다. "총 소비 용량" 방법을 사용한 OS 식균 작용 속도에 대한 영향을 포함하여 이러한 프로토콜을 활용한 리포푸신 독성에 대한 통찰력은 생체 내에서 리포푸신의 독성을 밝히는 데 사용될 것으로 예상됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353003</td>
			<td>Others also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LC3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4801S</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 1D4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#5417</td>
			<td>1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 4D2</td>
			<td>EnCor Biotech</td>
			<td>MCA-B630</td>
			<td>1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#23007</td>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td>Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy 493/503</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol esterase&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>From A12216 kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Stellaris SP8 with FALCON module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-adapted bovine retinas</td>
			<td>W. L. Lawson Company</td>
			<td>Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)</td>
			<td>Contact information: 
			https://wllawsoncompany.com/ 
			(402) 499-3161 
			stacy@wllawsoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Attune NxT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analysis software&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld UV light&#160;</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVGL-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MFG-E8</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>10853-H08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human purified Protein S</td>
			<td>Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J60015-AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>J2380</td>
			<td>LDH-Glo Cytotoxicity Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#72485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene-coated slides</td>
			<td>Tekdon</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Customized specifications: PTFE mask with the following &#34;cut-outs&#34; -&#160; 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000122 RC DC protein assay</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet crosslinker device</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVP CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved lipofuscin models and quantification of outer segment phagocytosis capacity in highly polarized human retinal pigment epithelial cultures

망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 "펄스 추적" 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

The retinal pigment epithelium (RPE) provides critical support for overlying photoreceptors, including the daily uptake and degradation of photoreceptor outer segment tips or fragments (throughout this protocol, the abbreviation OS stands for OS tips or fragments rather than whole outer segments). This daily uptake in the post-mitotic RPE eventually overloads phagolysosomal capacity and leads to the buildup of undigestible, autofluorescent intracellular material, termed lipofuscin. Interestingly, several studies have also demonstrated that RPE lipofuscin can accumulate without OS phagocytosis1,2. Lipofuscin has many components, including cross-linked adducts derived from visual cycle retinoids, and can occupy nearly 20% of RPE cell volume for those over the age of 803.
Whether lipofuscin is toxic has been hotly debated. Stargardt&#39;s disease is an autosomal recessive degeneration of the photoreceptors and RPE in which a mutation in ABCA4 triggers improper processing of visual cycle retinoids contained within photoreceptor outer segments. Improper retinoid processing leads to aberrant cross-linking and formation of bis-retinoid species, including the bis-retinoid N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E). Studies have demonstrated multiple mechanisms for A2E toxicity4,5. Lipofuscin contributes to fundus autofluorescence signals during clinical imaging, and both Stargardt&#39;s patients and animal models display increased fundus autofluorescence prior to retinal degeneration, suggesting a correlation between lipofuscin levels and toxicity6,7. However, with age, lipofuscin accumulates in all humans without triggering an RPE degeneration. Further, in age-related macular degeneration (AMD), where RPE degeneration occurs only in elderly patients, those with early and intermediate forms of the disease have less fundus autofluorescence signals than age-matched non-diseased humans8. These clinical findings have been verified at the histologic level as well9,10.
Animal models of RPE lipofuscin accumulation have also left some ambiguity about lipofuscin toxicity. The ABCA4 knockout mouse does not display retinal degeneration on a pigmented background, whereas it does on an albino background or when exposed to blue light11,12. Further, the toxicity of lipofuscin derived via ABCA4 knockout likely differs from the more slowly accumulating lipofuscin that occurs with natural aging, as seen in AMD13.
In vitro models of lipofuscin accumulation provide an alternative to studying the effects of lipofuscin accumulation on RPE health. Such models allow for manipulating lipofuscin components, from feeding single retinoid components to feeding OS, and allow study in human rather than animal RPE. In the last couple of decades, multiple methods have been developed to model RPE lipofuscin in culture. Along with other groups, Dr. Boulton&#39;s group fed bovine OS daily for up to three months on passage 4 to 7 human primary RPE cells from donors aged 4 to 85 years old14. Alternatively, inhibition of autophagy has also led to lipofuscin accumulation in passages 3 to 7 primary human RPE cultures15. However, sub-lethal lysosomal inhibition in highly differentiated, passage 1, primary human pre-natal RPE (hfRPE) cultures failed to induce lipofuscin, even with the repeated addition of OS on a daily basis16.
As a more reductionist approach, others have fed single lipofuscin components to cultures, especially the bis-retinoid A2E4,17. Such studies are valuable in that they define potential direct mechanisms of toxicity for individual lipofuscin components, implicating, for example, lysosomal cholesterol and ceramide homeostasis18. At the same time, there is debate about the toxicity of A2E19, and feeding it directly to cells circumvents the typical pathway for lipofuscin accumulation, which involves phagocytosis of photoreceptor OS. In an attempt to deliver all components of lipofuscin to RPE cultures, Boulton and Marshall purified lipofuscin from human eyes and fed this to passage 4 to 7 human primary RPE cultures derived from both fetal and elderly human donors20. While innovative, this method represents a limited lipofuscin source for repeated experiments.
While repeated feedings of OS to RPE cultures produce lipofuscin in many systems, it fails to do so in highly differentiated primary RPE cultures16. Photo-oxidizing OS induces cross-linking reactions like bis-retinoid formation that naturally occurs during lipofuscin formation in vivo. This can accelerate lipofuscin-like granule formation in RPE culture systems, even those that are highly differentiated and resistant to lipofuscin accumulation16. Here, a method to induce lipofuscin-like granule accumulation in highly differentiated hfRPE and human iPSC-RPE is introduced, modified from Wihlmark&#39;s published protocol21. This method has the advantage of inducing lipofuscin-like granules employing the same source (photoreceptor OS) and pathway (phagolysosomal OS uptake) as occurs for lipofuscinogenesis in vivo. Further, it is done on human RPE cultures that are highly differentiated and validated in multiple studies to replicate human RPE in vivo22,23,24. These lipofuscin-like granules are termed undigestible autofluorescent material (UAM), and provide data and discussion in this protocol comparing UAM to in vivo lipofuscin. Along with methods for building and evaluating UAM-laden cultures in highly differentiated human RPE, an updated method to assess RPE OS phagocytosis is also introduced. Multiple excellent pulse-chase methods for quantifying OS phagocytosis have been introduced, including Western blotting, immunocytochemistry, and FACS25,26,27. However, early in the OS pulse-chase, conditions that lead to poor OS uptake can be conflated with conditions that promote rapid degradation of internalized OS. The method presented here measures the total amount of introduced OS that is fully consumed/degraded by the RPE (&#34;Total Consumptive Capacity&#34;), helping eliminate this ambiguity. It is anticipated that insights about lipofuscin toxicity utilizing these protocols, including effects on OS phagocytosis rates utilizing the &#34;Total Consumptive Capacity&#34; method, will be used to shed light on the toxicity of lipofuscin in vivo.

저자 스포트라이트: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures  

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

While lipofuscin universally accumulates in the RPE with aging, discerning its toxicity has been difficult. Here, we develop protocols that allow us to develop lipofuscin-like accumulation in highly polarized and mature RPE cultures to help discern lipofuscin's effects on RPE physiology. Studying lipofuscin toxicity in humans is confounded by the fact that lipofuscin decreases as the RPE dies.Animal models of lipofuscin toxicity have had widely disparate results. We have carefully created in vitro models of lipofuscin-like material accumulation to facilitate the study of lipofuscin toxicity. The key to the success of our models is maintaining highly differentiated cultures while inducing lipofuscin genesis via the same process that triggers lipofuscin in vivo, namely phagocytosis of photoreceptor outer segments.Our in vitro protocol is unique in that lipofuscin-like material accumulates in RPE cultures that are highly differentiated to faithfully mimic RPE in vivo. In these circumstances, we found that RPE culture are highly resistant to the lipofuscin accumulation and to toxic effect from lipofuscin. Additionally, in the process of assaying for phenotypes induced by lipofuscin-like accumulation in our RPE cultures, we created a new type of phagocytosis assay called total consumptive capacity.This assay allows us to determine the entire capacity of the RPE to phagocytose outer segments while avoiding some of the confounding interpretations that come with classical pulse-chase phagocytosis assays. We are excited to utilize this model of lipofuscin-like material accumulation to better understand what RPE stressors may take normally inert lipofuscin into a more pathological role in RPE cell deaths.

OS의 광산화를 위한 설정은 그림 1Ai에 나와 있습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드는 슬라이드의 나머지 부분에 퍼지지 않고 열린 직사각형당 많은 양의 OS 용액을 로드할 수 있습니다. OS가 있는 슬라이드는 뚜껑이 벗겨진 멸균 페트리 접시 안에 들어 있으며 UV 램프는 그림 1Aii와 같이 슬라이드 위에 놓입니다. 대안적으로, 슬라이드는 <stro...

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이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

리포푸신은 노화와 함께 RPE에 보편적으로 축적되지만 독성을 식별하기는 어려웠습니다. 여기에서 우리는 RPE 생리학에 대한 리포푸신의 효과를 식별하는 데 도움이 되도록 고도로 분극되고 성숙한 RPE 배양에서 리포푸신과 유사한 축적을 개발할 수 있는 프로토콜을 개발합니다. 인간의 리포푸신 독성을 연구하는 것은 RPE가 죽으면서 리포푸신이 감소한다는 사실에 의해 혼란스럽습니다.리포푸신 독성의 동물 모델은 매우 이질적인 결과를 가져왔다. 우리는 리포푸신 독성 연구를 용이하게 하기 위해 리포푸신 유사 물질 축적의 시험관 내 모델을 신중하게 만들었습니다. 우리 모델의 성공의 열쇠는 생체 내에서 리포푸신을 유발하는 것과 동일한 과정, 즉 광수용체 외부 세그먼트의 식균 작용을 통해 리포푸신 생성을 유도하면서 고도로 분화된 배양을 유지하는 것입니다.당사의 체외 프로토콜은 생체 내에서 RPE를 충실하게 모방하기 위해 고도로 차별화된 RPE 배양에 리포푸신 유사 물질이 축적된다는 점에서 독특합니다. 이러한 상황에서 우리는 RPE 배양이 리포푸신 축적 및 리포푸신의 독성 효과에 대해 매우 내성이 있음을 발견했습니다. 또한 RPE 배양에서 리포푸신 유사 축적에 의해 유도된 표현형을 분석하는 과정에서 총 소비 용량이라는 새로운 유형의 식균 작용 분석을 만들었습니다.이 분석을 통해 우리는 고전적인 펄스 체이스 식균 작용 분석과 함께 제공되는 혼란스러운 해석을 피하면서 외부 세그먼트를 식균하는 RPE의 전체 용량을 결정할 수 있습니다. 우리는 RPE 스트레스 요인이 일반적으로 불활성 리포푸신을 RPE 세포 사멸에서 보다 병리학적인 역할로 이끌 수 있는 것을 더 잘 이해하기 위해 이 리포푸신 유사 물질 축적 모델을 활용하게 된 것을 기쁘게 생각합니다.

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Abstract