Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas

A fagocitose diária dos segmentos externos dos fotorreceptores pelo epitélio pigmentar da retina (EPR) contribui para o acúmulo de um pigmento envelhecido intracelular denominado lipofuscina. A toxicidade da lipofuscina está bem estabelecida na doença de Stargardt, a degeneração hereditária da retina mais comum, mas é mais controversa na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido. Determinar a toxicidade da lipofuscina em humanos tem sido difícil, e modelos animais de Stargardt têm toxicidade limitada. Assim, modelos in vitro que mimetizem o EPR humano in vivo são necessários para melhor compreender a geração, depuração e toxicidade da lipofuscina. A maioria dos modelos de lipofuscina em cultura celular até o momento foi em linhagens celulares ou envolveu a alimentação de EPR com um único componente da complexa mistura de lipofuscina em vez de fragmentos/pontas de todo o segmento externo do fotorreceptor, o que gera um modelo de lipofuscina mais completo e fisiológico. Descrito aqui é um método para induzir o acúmulo de material semelhante à lipofuscina (denominado material de autofluorescência não digestível, ou UAM) em EPR pré-natal humano primário altamente diferenciado (hfRPE) e PSE derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As MAU acumularam-se nas culturas por repetidas alimentações de fragmentos de OS tratados com luz ultravioleta absorvidos pelo EPR via fagocitose. As principais maneiras pelas quais o UAM se aproxima e difere da lipofuscina in vivo também são discutidas. Acompanhando esse modelo de acúmulo semelhante à lipofuscina, métodos de imagem para distinguir o amplo espectro de autofluorescência dos grânulos de UAM da coloração concomitante de anticorpos são introduzidos. Finalmente, para avaliar o impacto da MAU na capacidade de fagocitose do EPR, um novo método para quantificar a captação e a degradação de fragmentos/pontas do segmento externo foi introduzido. Denominado "Capacidade de Consumo Total", esse método supera potenciais erros de interpretação da capacidade de fagocitose do EPR inerente aos ensaios clássicos de "perseguição de pulso" do segmento externo. Os modelos e técnicas aqui introduzidos podem ser usados para estudar as vias de geração e depuração da lipofuscina e a toxicidade putativa.