Усовершенствованные модели липофусцина и количественная оценка способности фагоцитоза наружного сегмента в высокополяризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека

Ежедневный фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов пигментным эпителием сетчатки (RPE) способствует накоплению внутриклеточного пигмента старения, называемого липофусцином. Токсичность липофусцина хорошо известна при болезни Штаргардта, наиболее распространенной наследственной дегенерации сетчатки, но более противоречива при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причине необратимой слепоты в развитых странах. Определение токсичности липофусцина у людей было затруднено, а животные модели Штаргардта имеют ограниченную токсичность. Таким образом, модели in vitro , имитирующие человеческий RPE in vivo , необходимы для лучшего понимания генерации, клиренса и токсичности липофусцина. Большинство моделей липофусцина клеточных культур до настоящего времени были в клеточных линиях или включали кормление RPE одним компонентом сложной смеси липофусцина, а не фрагментами/кончиками всего внешнего сегмента фоторецептора, что создает более полную и физиологическую модель липофусцина. Здесь описан способ индуцирования накопления липофусциноподобного материала (называемого неперевариваемым автофлуоресцентным материалом, или UAM) в высокодифференцированном первичном пренатальном RPE человека (hfRPE) и индуцированном плюрипотентном стволовом клеточном (iPSC), полученном RPE. УАМ накапливался в культурах при многократном кормлении обработанных ультрафиолетовым светом фрагментов ОС, поглощенных РПЭ посредством фагоцитоза. Также обсуждаются ключевые способы, которыми UAM аппроксимируется и отличается от липофусцина in vivo . Сопровождая эту модель липофусциноподобного накопления, представлены методы визуализации, позволяющие отличить широкий спектр аутофлуоресценции гранул UAM от одновременного окрашивания антителами. Наконец, для оценки влияния UAM на способность к фагоцитозу RPE был введен новый метод количественной оценки поглощения и разрушения фрагментов/кончиков внешнего сегмента. Этот метод, получивший название «общая потребительская емкость», преодолевает потенциальные неправильные интерпретации способности к фагоцитозу RPE, присущие классическим анализам внешнего сегмента «погони за пульсом». Представленные здесь модели и методы могут быть использованы для изучения путей генерации и клиренса липофусцина, а также предполагаемой токсичности.