Direkt syntes av EM-synliga guldnanopartiklar i celler för proteinlokaliseringsanalys med välbevarad ultrastruktur

Att analysera den exakta lokaliseringen av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell upplösning är av stor betydelse för studier av olika fysiologiska eller patologiska processer i alla levande organismer. Därför är utvecklingen av klonbara taggar som kan användas som elektronmikroskopiprober av stort värde, precis som fluorescerande proteiner har spelat en avgörande roll inom optisk avbildning. Autonucleation suppression mechanism (ANSM) upptäcktes nyligen, vilket möjliggör specifik syntes av guldnanopartiklar (AuNP) på cysteinrika taggar, såsom metallotionein (MT) och frostskyddsprotein (AFP).

Baserat på ANSM utvecklades en elektronmikroskopimärkningsteknik som möjliggör specifik detektion av märkta proteiner i prokaryota och eukaryota celler med en oöverträffad märkningseffektivitet. Denna studie illustrerar ett protokoll för detektion av MTn (en konstruerad MT-variant som saknar aldehydreaktiva rester) fusionsproteiner i däggdjursceller med välbevarad ultrastruktur. I detta protokoll utfördes högtrycksfrysning och fryssubstitutionsfixering med användning av icke-aldehydfixeringsmedel (såsom garvsyra, uranylacetat) för att bevara nästan naturlig ultrastruktur och undvika skador på taggaktiviteten orsakad av aldehydtvärbindning.

En enkel enstegs rehydrering användes före den ANSM-baserade AuNP-syntesen. Resultaten visade att de märkta proteinerna riktade sig mot olika organeller, inklusive membranen och lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), och mitokondriella matriser detekterades med hög effektivitet och specificitet. Denna forskning ger biologer ett robust protokoll för att ta itu med ett enormt antal biologiska frågor på enmolekylnivå i cellulära ultrastrukturella sammanhang.