בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

Abstract

רוב התהליכים הפיזיולוגיים והמחלות, החל מחילוף חומרים מרכזי ועד תגובה חיסונית לניוון עצבי, כרוכים במיטוכונדריה. הפרוטאום המיטוכונדריאלי מורכב מיותר מ-1,000 חלבונים, והשפע של כל אחד מהם יכול להשתנות באופן דינמי בתגובה לגירויים חיצוניים או במהלך התקדמות המחלה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה מתאים ראשוניים ומרקמות. ההליך הדו-שלבי כולל (1) הומוגניזציה מכנית וצנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד מיטוכונדריה גולמית, ו-(2) לכידה חיסונית ללא תגים של מיטוכונדריה כדי לבודד אברונים טהורים ולחסל מזהמים. חלבונים מיטוכונדריאליים מכל שלב טיהור מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסות כמותית, ומחושבת תפוקת העשרה, המאפשרת גילוי של חלבונים מיטוכונדריאליים חדשים על ידי פרוטאומיקה חיסורית. הפרוטוקול שלנו מספק גישה רגישה ומקיפה לחקר תכולת המיטוכונדריה בשורות תאים, תאים ראשוניים ורקמות.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים ודינמיים המסוגלים לחוש ולהסתגל לצרכים המטבוליים של התא. מיטוכונדריה, המרכיב המרכזי במורכבות חילוף החומרים בתאים, פועלים כמרכזים מטבוליים שבהם מתכנסים תגובות מטבוליזם של פחמימות, חלבונים, שומנים, חומצות גרעין וקו-פקטורים¹. הם משמשים גם כאברוני איתות למסלולים של התגובה החיסונית המולדת ובתגובה לשינויים ביונים ובמיני חמצן תגובתי ^2,3. עד כה, כ-1,100 חלבונים מופו למיטוכונדריה ^4,5,6, אך אנו יכולים להניח שנותרו עוד חלבונים רבים להתגלות^, במיוחד אלה המתבטאים רק בסוגי תאים מסוימים או באופן ארעי בתנאי סביבה ספציפיים. פיתוח גישות חדשות לכימות שינויים בהרכב המיטוכונדריה במצבי עניין מטבוליים יגביר את הידע שלנו על אברונים אלה וידגיש דרכים טיפוליות חדשות להפרעות המאופיינות בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה⁷.

נכון לעכשיו, קיימים פרוטוקולים שונים לבידוד מיטוכונדריה, עם תפוקות שונות ורמות טוהר שונות⁸. גישות מבוססות צנטריפוגה הן הפופולריות ביותר, בשל פשטותן ועלותן הנמוכה. למרות שהיא מתאימה לרוב היישומים, לצנטריפוגה דיפרנציאלית יש את החיסרון של השגת טוהר מיטוכונדריאלי נמוך יותר ודורשת כמויות גדולות של חומר מוצא כאשר משתמשים ביישומים מורכבים יותר מבוססי שיפוע צפיפות. בשנים האחרונות התפתחו שיטות חדשות לבידוד מיטוכונדריה, כגון לכידה חיסונית מבוססת תגיות ("MITO-IP")⁹ ומיון אברונים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות¹⁰. למרות ששני ההליכים יכולים לייצר דגימות עם טוהר גבוה, הראשון דורש הנדסה גנטית כדי לתייג מיטוכונדריה לטיהור אהדה, מה שהופך את הפרוטוקולים לבלתי תואמים לחומר ראשוני מאורגניזמים שלא עברו שינוי או מתורמים אנושיים. בינתיים, האחרון תלוי בגישה לציטומטריית זרימה ומכשירי מיון. שילוב שיטות בידוד שונות מציע הבטחה ליצירת פרוטוקולים חזקים יותר וטוהר מוגבר.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש לבידוד מיטוכונדריה המבוסס על שילוב של שתי שיטות קיימות: (1) צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד מקטע מיטוכונדריאלי גולמי, ו-(2) לכידה חיסונית ללא תגים של מיטוכונדריה עם חרוזים על-פאראמגנטיים הקשורים באופן קוולנטי לנוגדנים כנגד טרנסלוקז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 22 (Tomm22)¹¹, חלבון מיטוכונדריאלי חיצוני שנמצא בכל מקום (איור 1)). ההליך שאנו מתארים תואם לספקטרומטריית מסת חלבונים כמותית, ומכיוון שהוא נטול תגים ואינו דורש מניפולציה גנטית, ניתן ליישם אותו במגוון רחב של מודלים מחקריים, החל מקווי תאים, דרך נוזלי גוף ועד רקמות שלמות של בעלי חיים. יתר על כן, השימוש בשני שלבים בפרוטוקול מאפשר שימוש בפרוטאומיקה חיסורית ^6,12 לגילוי חלבונים מיטוכונדריאליים חדשים ולחקר ביטוים.

Protocol

יש ללבוש כפפות בכל עת ולבצע צעדי תרבית תאים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. התאים נשמרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. המחקר המוצג בפרוטוקול זה אושר ובוצע בהתאם להנחיות אוניברסיטת לוזאן ושוויץ לשימוש בבעלי חיים.

1. תרבית של קו תאי מקרופאג RAW264.7

1. לגדל את המקרופאג' RAW264.7 של עכברים במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז וגלוטמין גבוהים בתוספת סרום בקר עוברי 5% מומת חום (HI-FBS) ו-100 IU/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (P/S).
   הערה: כדי לבודד מיטוכונדריה, צלחת אחת בקוטר 15 ס"מ (בערך 70 x 10⁷ תאים גולמיים 264.7) מספיקה.
2. שמור על תאי RAW264.7 בלוחיות תרבית רקמה. צפיפות זריעה ראשונית של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל מובילה לצלחת מפגש תוך 3 ימים. השתמש 25 מ"ל של תרחיף התא במדיה עבור צלחת 15 ס"מ. לתאי RAW264.7 יש קצב חלוקת תאים גבוה ויש לפצל אותם בתדירות גבוהה יותר מרוב קווי התאים.
3. ניתוק תאי RAW264.7
   1. שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
   2. לקבלת צלחת בקוטר 15 ס"מ, הוסיפו 8 מ"ל של חיץ דיסוציאציה גולמי חם (270 מ"מ אשלגן כלורי, 30 מ"מ נתרן ציטראט דיהידרט ב-H₂O, סטרילי מסונן) ודגרו על התאים ב-37°C למשך 5 דקות.
   3. הוסף נפח שווה ערך של מדיה ללוחות (דילול 1:1 של חיץ הדיסוציאציה), ופיפטה כדי לנתק ולהפוך את התאים להומוגניים.
   4. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי וצנטריפוגות את הצינור ב 300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיה (המתואר בשלב 1.1) לספירת תאים.
      הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לניתוק תאי RAW264.7, כגון טריפסין או מגרד תאים. עם זאת, שיטות אלה קשות יותר על התאים ועלולות להוביל לקיטוב שלהם למקרופאגים דמויי M1 בימים שלאחר הניתוק.

2. בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM)

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מיועד לעכבר יחיד וניתן להגדיל אותו עבור עכברים מרובים. פרוטוקולים מפורטים לבידוד ותרבות BMDM תוארו במקומות אחרים^13,14.

1. הקריבו עכבר C57BL/6 בן 8-12 שבועות עם מינון גבוה של CO₂.
   הערה: ניתן להשתמש בעכברים זכרים או נקבות.
2. רססו את העכבר באתנול 75% כדי לעקר אותו.
3. נתחו ואספו את הירכיים, עצם הירך והטיביאס מהעכבר¹⁵.
4. כדי לאסוף את מח העצם מן עצם הירך ואת tibias, להסיר את קצה מפרק הברך של שתי העצמות¹⁵. לשחזר מח עצם מן הירכיים על ידי הסרת acetabulum.
5. מעבירים את העצמות לצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 4 מ"ל של מדיה BMDM שנשמרת על קרח (DMEM עם גלוקוז גבוה וגלוטמין בתוספת 5% HI-FBS, P/S ו-10 mM HEPES).
   הערה: חשוב לשמור את העצמות במדיה כדי למנוע התייבשות של מח העצם במהלך דיסקציה.
6. הוסף 4 מ"ל של PBS ו 4 מ"ל של מדיה BMDM חם בשתי בארות שונות של צלחת 6 בארות.
7. מעבירים את העצמות ואת המדיה מצינור החרוטי 50 מ"ל לבאר ריקה של צלחת 6 בארות.
8. באמצעות זוג מלקחיים, להעביר את העצמות PBS היטב כדי לשטוף אותם.
9. מעבירים את העצמות לבאר המכילה מדיה BMDM חמה.
10. צור חור בקוטר 1-2 מ"מ בתחתית שני צינורות 0.5 מ"ל עם המלקחיים והניחו אותם בצינור 1.5 מ"ל.
    הערה: אין צורך להוסיף מדיה לצינור עבור שלב מהיר זה.
11. בכל צינור של 0.5 מ"ל, הניחו את עצם הירך, השוקה והירך באופן כזה שמח העצם של העצמות החשופות פונה לכיוון תחתית הצינורות.
12. צנטריפוגה את הצינורות ב 13,000 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את מח העצם ושאריות מדיה דרך החור של צינור 0.5 מ"ל לתוך צינור 1.5 מ"ל. השליכו את צינורות 0.5 מ"ל עם העצמות.
13. להשעות מחדש את כדורי מח העצם במדיה BMDM ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל.
14. הוסף מדיית BMDM עד 10 מ"ל.
15. מניחים מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל ומסננים דרכו את תרחיף מח העצם.
16. צנטריפוגה את המתלה המסונן ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את התאים שלמים ולהסיר פסולת קטנה מן השעיית התא.
17. הכינו 70 מ"ל של מדיית BMDM בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF).
18. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של מדיית BMDM בתוספת M-CSF.
19. הוסיפו 9 מ"ל של מדיית BMDM בתוספת M-CSF לכל אחת משבע צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ.
20. צלחת 1 מ"ל של תאים (סביב 1 x 10⁷ תאים) בכל אחד משבעת צלחות פטרי 10 ס"מ.
21. הומוגניזציה של תרחיף התא בכל צלחת על ידי זילוף בזהירות למעלה ולמטה על הצלחת ולהעביר את הלוחות לאינקובטור.
22. לאחר 3 ימים, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיית BMDM חמה בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל m-csf לכל צלחת.
23. לאחר 3 ימים (יום 6, לאחר בידוד מח עצם), יש לוודא הידבקות והתמיינות של BMDM במיקרוסקופיה.
    הערה: בשלב זה, ניתן להמשיך ישירות לבידוד מיטוכונדריה (שלב 3). לחילופין, ניתן להפעיל מחדש את ה-BMDM, מה שמאפשר לטפל בהם עם ציטוקינים ומולקולות קטנות.
24. ניתוק BMDMs
    1. שאפו את המדיה מכל צלחת והוסיפו 7 מ"ל של PBS קר בתוספת 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
    2. לדגור על התאים ב 4 ° C במשך 7-8 דקות.
    3. נתק את BMDMs על ידי זינוק זהיר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
    4. אחסן יחד את ה- BMDMs התלויים מחדש מכל שבעת הלוחות לצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב-40 מ"ל של מדיית BMDM חמה לספירת תאים.
       הערה: בין 7-9 x 10⁷ BMDM מתקבלים לכל עכבר. מומלץ לפחות 6 x 10⁷ BMDM לבידוד מיטוכונדריה עבור פרוטאומיקה.
    6. אם תרצה, צלחת ולטפל BMDMs בהתאם למטרת הניסוי. אם לא, המשך ישירות לשלב 3.3.

3. הכנת מקטע מיטוכונדריאלי גולמי על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית

הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב- 4 °C. דרושות שתי צנטריפוגות האחת עם רוטור מתנדנד ומתאמים לצינורות חרוטיים בעלי כוח צנטריפוגלי יחסי של לפחות 300 x גרם, והשנייה עם כוח צנטריפוגלי יחסי של לפחות 21,000 x g המתאים לצינורות 1.5 מ"ל. בעת שימוש בתאים דבקים, השתמש במגרד תאים.

1. עבור תאים דבקים, לשאוף את המדיה ולהוסיף 10 מ"ל של PBS לכל צלחת 15 ס"מ.
   הערה: גירוד תאים ב- PBS מאפשר לשטוף אותם בו זמנית. אם התאים כבר נמצאים בהשעיה, המשך ישירות לשלב 3.3.
2. נתקו את התאים באמצעות מגרד תאים ואגרו אותם בצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל. הומוגניזציה של תרחיף התא על ידי pipeting למעלה ולמטה.
   הערה: ניתן לנתק תאים באמצעות מגרד תאים, מכיוון שזה מהיר יותר והם יעברו ליזה זמן קצר לאחר מכן.
3. עבור כל תנאי ניסוי, להעביר 5% מנפח תרחיף התא לצינור 1.5 מ"ל ולצנוח אותו ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בעת שימוש בתאי תרחיף, הקפד לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS לפני, כדי להסיר מזהמים אפשריים מהמדיה כגון FBS.
4. השליכו את הסופרנאטנט והשאירו את הגלולה על קרח.
   הערה: זה ייצג את החלק "התא הכולל" עבור פרוטאומיקה.
5. צנטריפוגה את שאר הדגימות משלב 3.1 או 3.2 ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. בצע את כל השלבים הבאים על קרח ובאמצעות מאגרים קרים כקרח.
7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של חיץ מיטוכונדריה קר כקרח (MB) (210 מילימטר מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ HEPES/NaOH [pH 7.4] ו-1 מ"מ EDTA).
8. לשחזר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
9. להשעות את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של MB קר ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל.
   הערה: הליך זה מניב ריכוז תאים משוער של 1.5 x 10 8 תאי BMDM/מ"ל או 3 x 10⁸ תאי RAW264.7/מ"ל.
10. באמצעות מזרק בנפח 1 מ"ל המצויד במחט של 25 גרם, ערכו הומוגניות לתרחיף התא על-ידי 30 מעברים דרך המחט (איור 1A).
11. הוסף 1 מ"ל של MB קר לצינור וערבב על ידי היפוך. צנטריפוגה את תרחיף התא ההומוגני ב 2,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
12. מעבירים 1 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור טרי של 1.5 מ"ל על קרח מבלי להפריע לכדורית התא. השהה מחדש את גלולת התא והומוגניזציה שלה שוב, כמו בשלב 3.7.
13. אגרו את גלולת התא ההומוגנית ואת הסופרנאטנט משני השלבים הקודמים בצינור יחיד של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה אותו ב 2,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: בשלב זה, הגלולה מכילה בעיקר גרעינים ותאים לא שבורים והיא מושלכת. הסופרנאטנט מכיל פסולת תאית, ציטוזול ואברונים, כולל מיטוכונדריה (איור 1B).
14. מחלקים את הסופרנאטנט בין ארבעה צינורות של 1.5 מ"ל.
    הערה: חלוקת הסופרנאטנט בין צינורות מרובים בשלב זה משפרת את הסרת המזהמים בשלבים הבאים.
15. הוסף MB כדי ליצור נפח סופי של 1 מ"ל בכל אחד מארבעת הצינורות. מערבבים על ידי היפוך וצנטריפוגה את הצינורות ב 13,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    הערה: לאחר שלב זה, גלולה עם שתי שכבות גלויה. הגלולה התחתונה, המוצקה והחומה, מכילה מיטוכונדריה ונשמרת לטיהור נוסף (איור 1C). הגלולה העליונה, הרופפת, הלבנה מכילה מבנים תאיים אחרים וניתן להשליכה.
16. בצע שלב זה בזהירות. מוציאים את הסופרנאטנט עם כמה שיותר מהגלולה העליונה הלבנה. על ידי פיפטינג עדין על זה, ניתן להשעות מחדש את הגלולה הלבנה ולאחר מכן להשליך אותו, משאיר את הגלולה המיטוכונדריאלית החומה שלמה.
17. שמור את אחד מארבעת הצינורות עם הגלולה המיטוכונדריאלית על קרח. זה מייצג את החלק "מיטוכונדריה גולמית" עבור פרוטאומיקה.
18. אגרו יחד את שלושת הכדוריות האחרות בצינור של 1.5 מ"ל בנפח סופי של 1 מ"ל של MB.

4. טיהור מבוסס נוגדנים על-פאראמגנטיים של מיטוכונדריה

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בחדר קר בטמפרטורה של 4°C.

1. העבר 1 מ"ל של התכשיר המיטוכונדריאלי הגולמי משלב 3.18 לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף 7 מ"ל של MB בתוספת 150 mM NaCl (MB + NaCl).
   הערה: הוספת NaCl משפרת את קשירת הנוגדנים ומפחיתה קשירה לא ספציפית של המזהמים לחרוזים ולמיטוכונדריה.
2. הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזי Tomm22 לתרחיף המיטוכונדריה הגולמי בנפח 8 מ"ל (איור 1D) ודגרו על הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C על גלגל מסתובב במהירות נמוכה.
   הערה: חרוזי Tomm22 קשורים באופן קוולנטי לנוגדנים חד-שבטיים Tomm22 המוגדלים בעכבר, יחד עם חרוזים על-פאראמגנטיים.
3. בינתיים, הניחו עמוד על המגנט.
4. אזן את העמודה עם 8 מ"ל של MB + NaCl ומחק את הזרימה.
5. לאחר הדגירה של 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס של הדגימה עם חרוזי Tomm22, העבירו את הדגימה לעמודה. מחק את הזרימה.
   הערה: מיטוכונדריה יישארו מחוברים לחרוזים המגנטיים בעמוד (איור 1E).
6. שטף את העמודה שלוש פעמים עם 8 מ"ל של MB + NaCl.
7. הסר את העמוד מהמגנט ומקם אותו בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
8. הצהירו את המיטוכונדריה על ידי הוספת 1.5 מ"ל של MB + NaCl לעמודה, והפעילו בוכנה באופן מיידי כדי להאיר את המיטוכונדריה המטוהרים לתוך הצינור.
9. מעבירים את המיטוכונדריה המדוללת לצינור בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 21,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
   הערה: תיווצר גלולה חומה. זה מכיל את המיטוכונדריה המבודדת וחלק מהחרוזים המצומדים לנוגדנים (איור 1F).
10. מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט מהכדור. הגלולה מייצגת את החלק "המיטוכונדריה הטהורה" עבור פרוטאומיקה. גלולה זו יחד עם הכדוריות משלבים 3.4 ו-3.17 ניתנות לאחסון בטמפרטורה של -20°C ומוכנות ליישומים במורד הזרם.

Discussion

שילבנו צנטריפוגה דיפרנציאלית ולכידת חיסון כדי להשיג טוהר משופר לבידוד מיטוכונדריה. ההליך שלנו מאפשר גישה לחומר ראשוני לזיהוי ואפיון חלבונים מיטוכונדריאליים חדשים. הפרוטוקול פשוט וחזק, וניתן ליישם אותו על קווי תאים, תאים ראשוניים ורקמות ללא צורך בשינוי גנטי. תיקפנו את הפרוטוקול שלנו על ידי ניתוחי אימונובלוטיקה ופרוטאומיקה על דגימות שנלקחו בשלבים שונים לאורך תהליך הטיהור.

בהשוואה לשיטות בידוד בודדות, השילוב של שלבי העשרה בעלי אופי שונה - כאן, צנטריפוגה ותיוג חיסוני - מייצר פרוטוקול חזק יותר לבידוד מיטוכונדריה. הסיבה לכך היא שבעוד חלבונים מיטוכונדריאליים יועשרו בשני הטיהורים, לא סביר שגם מזהמים יועשרו לאחר שני שלבי ההעשרה. למרות טוהר מיטוכונדריאלי גבוה יכול להיות מושג גם על ידי צפיפות הדרגתית ultracentrifugation, גישה זו דורשת כמות גדולה של חומר מוצא וגישה אולטרה צנטריפוגה. לבסוף, בניגוד לשיטות עדכניות המבוססות על בידוד מיטוכונדריאלי מבוסס תגים²⁰, הגישה שלנו אינה דורשת שינוי גנטי של הדגימה, מה שהופך אותה מתאימה לחומר ראשוני מכל מקור שהוא.

כמה שיקולים טכניים וביולוגיים צריכים להילקח בחשבון בתכנון הניסוי בעת יישום הפרוטוקול שלנו. (1) כמות חומר המוצא היא קריטית על מנת לקבל חומר מספיק. באופן בלתי נמנע, מספר קטן של מיטוכונדריה יאבד במהלך הומוגניזציה (שלב 3.10), מכיוון שלא כל התאים עוברים ליזה, או במהלך שטיפת שלושת הטורים (שלב 4.6). בעוד שהפרוטוקול שלנו מתמקד בטוהר על פני יבול, יעילות בידוד המיטוכונדריה, ומכאן התפוקה שלהם, לא נמדדה או עברה אופטימיזציה. שימוש ביותר חרוזי Tomm22 ויותר עמודות צפוי להגדיל את תפוקת התאוששות המיטוכונדריה. יחד עם זאת, אופטימיזציה יסודית של שלב ההומוגניזציה יכולה גם להוביל לשיפור התשואה במיטוכונדריה. פרוטוקול זה ומספרי התאים הראשוניים שאנו מדווחים עליהם כאן עבור תאי RAW264.7 ו- BMDM מתאימים לפרוטאומיקה וניתן להתאים אותם ליישומים אחרים. במקרה של BMDM ראשוניים, מצאנו כי עכבר אחד היה מספיק עבור שכפול אחד. במידת הצורך, ניתן להרחיב את ההליך כדי לבודד BMDMs מבעלי חיים מרובים, אשר לאחר מכן ניתן לאגד כדי לקבל מספיק חומר. ניתן למטב את מספר התא בהתאם לסוג התא, גודלו ותכולת המיטוכונדריה שלו. (2) Tomm22 מבוטא על מיטוכונדריה מכל סוגי התאים והרקמות²¹אך רמת הביטוי שלו עשויה להשתנות., לכן, כאשר מתכננים ניסוי להשוואת תנאים שונים, חשוב לוודא שרמות הביטוי של Tomm22 דומות. יתר על כן, בשל הביטוי הנפוץ של Tomm22, לא ניתן לחקור חלבונים מיטוכונדריאליים ספציפיים מסוג תא בתוך רקמות מורכבות. (3) הזמן הדרוש ליצירת מיטוכונדריה טהורה (בסביבות 2.5 שעות) אינו עולה בקנה אחד עם מחקר של אירועים חולפים, כגון שינויים בפרופילים מטבוליים. במקרה זה, אנו ממליצים על לכידה חיסונית ישירה מבוססת תגים⁹מה שמאפשר גם לחקור מיטוכונדריה ספציפית לסוג התא., in vivo²⁰. (4) למרות שמחקרים על מיטוכונדריה מבודדים שהתקבלו באמצעות חרוזים המסומנים בנוגדנים Tomm22 בלבד הראו פעילות בבדיקות תפקודיות¹¹נותר לקבוע אם מיטוכונדריה הנוצרים באמצעות הפרוטוקול שלנו תואמים לבדיקות מבוססות פעילות במורד הזרם., צביעת מיטוכונדריה או טטרמתילרודאמין מתיל אסטר פרכלורט (TMRM), או מדידות רספירומטריה, הן גישות פוטנציאליות לכימות הפונקציונליות של מיטוכונדריה מבודדת²². (5) לאחר הוצאת הדגימה "מיטו-טהורה" מהעמודה, חלק מחרוזי Tomm22 יהיו נוכחים במקטע המיטוכונדריה הטהור (איור 2B). אמנם לא ראינו הפרעה לעיכול טריפסין ולספקטרומטריית מסת חלבונים, אך יש לקחת בחשבון את נוכחותם של חרוזים אלה ואת האימונוגלובולינים ביישומים אחרים במורד הזרם. נוגדן Tomm22 הוא נוגדן חד שבטי המיוצר בעכברים²³ולכן חשוב לזכור כי, בעת שימוש נוגדנים משניים נגד עכברים immunoblotting, זה ייצור להקות לא ספציפיות בגודל של שרשראות אימונוגלובולינים., (6) הומוגניזציה מלאה של תרחיף התא היא המפתח לבידוד מוצלח של מיטוכונדריה. כאן, אנו משתמשים מזרק עם מחט 25 G כדי lyse הן RAW264.7 תאים BMDM. עם זאת, בהתאם לסוג התא וגודלו, שיטות הומוגניזציה מכניות אחרות, כגון שימוש בהומוגנייזר Dounce, או גישות מבוקרות יותר כמו התקני הומוגנייזר תא, עשויות להיות מתאימות יותר. ניתן לשקול גם שיטות הומוגניזציה לא מכניות, כגון סוניקציה עדינה. גישות הומוגניזציה של רקמות נדונות עוד יותר במחקרים אחרים^24,25. (7) למרות שתיקוף על ידי אימונובלוטינג היא השיטה הפשוטה והזולה ביותר, התוצאות שלה לא תמיד עשויות להיות מתואמות עם שינויים ברמת האברון כולו. לכן אנו ממליצים להשתמש בפרוטאומיקה כדי לאמת באופן מלא את ההעשרה או הדלדול של מיטוכונדריה ואברונים אחרים, בהתאמה.

פרוטוקול טיהור המיטוכונדריה הדו-שלבי המתואר כאן אפשר לנו לייצר דגימות רציפות עם טוהר מיטוכונדריאלי הולך וגדל, וזה אפשר לנו לגלות מועמדים חדשים לחלבון מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטאומיקה¹² חיסורית. לצורך הניתוח שלנו, אנו משתמשים בערכי סף מחמירים כדי לבחור חלבונים מיטוכונדריאליים מועשרים באופן משמעותי, ואף על פי שזה עלול להיכשל בזיהוי כמה חלבונים מיטוכונדריאליים ידועים (איור 3A), שיעור החיוביים הכוזבים לגילוי חלבונים מיטוכונדריאליים חדשים יורד. עם זאת, חשוב להדגיש כי כל חלבון מועמד המתגלה על ידי הפרוטוקול שלנו חייב להיות מאומת באמצעות גישות אורתוגונליות. אנו ממליצים על תיוג GFP מסוף קרבוקסי או על שימוש בנוגדנים כנגד החלבון האנדוגני כדי לאמת את הקשר עם מיטוכונדריה באופן מיקרוסקופי או על ידי בדיקות הגנה מפני פרוטאזות.

היישום הישיר של השיטה שלנו במקרה של תאים ורקמות שלא שונו מציע כלי רב עוצמה לחקור כיצד מיטוכונדריה משתנים ומסתגלים לסביבתם בתנאים בריאים ומחלות. יישום הפרוטוקול שלנו על קווי תאים, מודלים של מחלות בעלי חיים, נוזלים אנושיים ואפילו ביופסיות מניתוח עשוי להיות שימושי במיוחד כדי לשפר את ההבנה שלנו של מיטוכונדריה וההפרעות הקשורות אליהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD Plastipal	309628
25 G Needle	BD Microlance	300400
40 µm cell strainer	Corning	352340
Anti-TOM22 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-127-693
Cell scraper	FisherScientific	11577692
DMEM, high glucose, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Ethylenediaminetetraacetic acid	FisherScientific	BP-120-1
Fetal bovine serum	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS columns and plungers	Miltenyi Biotec	130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor	Immunotools	12343115
Mannitol	Sigma	M4125
Sodium chloride	Sigma	71380
Sucrose	Sigma	S1888
Penicillin/Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Petri dishes	Corning	BH93B-102
Phosphate-buffered saline 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter	C19196