דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Summary

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

Abstract

הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.

ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.

Introduction

השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)¹. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)^1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11

Protocol

כל הניסויים וההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיי?.......

Discussion

לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה³². במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם ת?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections