Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Summary

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Abstract

O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.

O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.

Introduction

A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)¹. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)^1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários ....

Protocol

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,.......

Discussion

Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente³². Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes³⁰. Isso perm.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections