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A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.
O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.
A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários ....
Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,.......
Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.
Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2.......
Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso perm.......
Os autores não têm nada a revelar.
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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