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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Abstract

O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.

O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.

Introduction

A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários ....

Protocol

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,.......

Representative Results

Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.

Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2.......

Discussion

Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso perm.......

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50010-01Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glassFisher Scientific12-541ACover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)PluriSelect#43-50030-03Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978ZMicroslide to mount SV on
C57BL/6J MiceThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell CounterLogos BiosystemsL20001Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mmBiomedical Research Instruments15-1020Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1ChromiumPN-1000141Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polishFisher ScientificNC1849418Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 wellCorning08-772BCulture dish used to hold specimen during dissection
DAPIInvitrogenD1306, RRID: AB_2629482Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizerSigma-AldrichD8938Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-30General forceps for dissection
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11255-20Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000044Used for steps of sNuc-Seq
Glue stickFisher ScientificNC0691392Used for mounting SV
GS-IB4 AntibodyMolecular ProbesI21411, RRID: AB-2314662Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Micen/an/aTransgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2ThermoFisherAM9530GUsed for steps of sNuc-Seq
Mounting reagentThermoFisher#S36940Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plateCorning#353047Plate used for immunostaining
NaClThermoFisherAAJ216183Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free waterThermoFisher4387936Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shakerSilent ShakeSYC-2102AUsed for steps of immunostaining
PBSThermoFisherJ61196.APUsed for steps of immunostaining and dissection
RNA LaterInvitrogenAM7021Used for preservation of SV for sNuc-Seq
ScizzorsFine Science Tools14058-09Used for splitting mouse skull
Tris-HClSigma-Aldrich15506017Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stainGibco15250061Used for cell counting
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscopeZeissn/aMicroscope used for dissections

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