A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.
בתאים אאוקריוטים, מרכיבי הממברנה, כולל חלבונים ושומנים, מועברים באופן מרחבי-זמני ליעדם בתוך מערכת האנדוממברנה. זה כולל הובלה הפרשה של חלבונים מסונתזים חדשים אל פני התא או אל מחוץ לתא, הובלה אנדוציטית של מטענים חוץ-תאיים או רכיבי קרום פלזמה לתוך התא, והובלה מיחזור או העברה של מטענים בין האברונים התת-תאיים וכו'. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות, צמיחה והסתגלות סביבתית של כל התאים האיקריוטים, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה. קינאזות קולטן פני השטח של התא, אשר קולטות אותות ליגנד מהמרחב החוץ-תאי, עוברות הן הובלה הפרשה והן הובלה אנדוציטית. גישות נפוצות לחקר אירועי סחר בממברנות באמצעות קינאז קולטן לאוצין עשיר בחזרת פלזמה, ERL1, מתוארות כאן. הגישות כוללות הכנת חומר צמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית. כדי לעקוב אחר הוויסות המרחבי-זמני של ERL1, מחקר זה מתאר את ניתוח הלוקליזציה המשותפת בין ERL1 לבין חלבון סמן גוף רב-שלפוחיתי, RFP-Ara7, ניתוח סדרות הזמן של שני חלבונים אלה, וניתוח מחסנית z של ERL1-YFP שטופל במעכבי סחר בקרום ברפלדין A וורטמנין.
תנועת ממברנות היא תהליך תאי שמור המפיץ רכיבי ממברנה (הידועים גם בשם מטענים), כולל חלבונים, שומנים ומוצרים ביולוגיים אחרים, בין אברונים שונים בתוך תא אאוקריוטי או על פני קרום הפלזמה אל החלל החוץ תאי וממנו1. תהליך זה מתאפשר על ידי אוסף של ממברנות ואברונים הנקראים מערכת האנדוממברנה, המורכבת מקרום הגרעין, הרשתית האנדופלסמית, מנגנון גולג'י, החללית / ליזוזומים, קרום הפלזמה ואנדוזומים מרובים1. מערכת האנדוממברנה מאפשרת שינוי, אריזה ושינוע של רכיבי הממברנה באמצעות שלפוחיות דינמיות העוברות בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות תאים, גדילה והסתגלות סביבתית, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה ומורכבת....
1. הכנת הפתרונות
מחקר קודם הצביע על כך ש-ERL1 הוא קולטן קינאז פעיל שעובר אירועי סחר דינמיים בממברנות20. ERL1 הוא קינאז קולטן LRR טרנסממברנה על קרום הפלזמה. ERL1 מסונתז חדש ברשתית האנדופלסמית מעובד בגופי גולג'י ומועבר הלאה לקרום הפלזמה. מולקולות ERL1 על קרום הפלזמה יכולות לקלוט ליגנדות EPF באמצעות תחום LRR
מערכת האנדוממברנה מפרידה את הציטופלסמה של התא האיקריוטי לתאים שונים, מה שמאפשר את התפקוד הביולוגי המיוחד של אברונים אלה. כדי להעביר חלבוני מטען ומקרומולקולות ליעדם הסופי בזמן הנכון, שלפוחיות רבות מונחות לעבור בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות מוסדרים מאוד ממלאים תפקידים בסיסיים בכדא?.......
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-2217757) (X.Q.) ופרס קרן ברונסון של אוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (UAMS) (H.Z).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved