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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale.

Abstract

Nelle cellule eucariotiche, i componenti della membrana, comprese le proteine e i lipidi, vengono trasportati spaziotemporalmente a destinazione all'interno del sistema endomembrana. Ciò include il trasporto secretorio di proteine di nuova sintesi sulla superficie cellulare o all'esterno della cellula, il trasporto endocitico di carichi extracellulari o componenti della membrana plasmatica nella cellula e il riciclaggio o il trasporto di carichi tra gli organelli subcellulari, ecc. Gli eventi di traffico di membrana sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l'adattamento ambientale di tutte le cellule eucariotiche e, quindi, sono sottoposti a una regolamentazione rigorosa. Le chinasi recettoriali della superficie cellulare, che percepiscono i segnali del ligando dallo spazio extracellulare, subiscono sia il trasporto secretorio che quello endocitico. Gli approcci comunemente usati per studiare gli eventi di traffico di membrana utilizzando una chinasi recettoriale ricca di ripetizione leucina localizzata nella membrana plasmatica, ERL1, sono descritti qui. Gli approcci includono la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale. Per monitorare la regolazione spaziotemporale di ERL1, questo studio descrive l'analisi di co-localizzazione tra ERL1 e una proteina marcatrice del corpo multi-vescicolare, RFP-Ara7, l'analisi delle serie temporali di queste due proteine e l'analisi z-stack di ERL1-YFP trattata con gli inibitori del traffico di membrana brefeldina A e wortmannin.

Introduction

Il traffico di membrana è un processo cellulare conservato che distribuisce componenti di membrana (noti anche come carichi), tra cui proteine, lipidi e altri prodotti biologici, tra diversi organelli all'interno di una cellula eucariotica o attraverso la membrana plasmatica da e verso lo spazio extracellulare1. Questo processo è facilitato da un insieme di membrane e organelli chiamati sistema endomembrana, che consiste nella membrana nucleare, nel reticolo endoplasmatico, nell'apparato di Golgi, nel vacuolo / lisosomi, nella membrana plasmatica e negli endosomi multipli1. Il sistema endomembrana consente la modifica, i....

Protocol

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare la soluzione di sterilizzazione dei semi mescolando 15 ml di candeggina con 35 ml di acqua distillata e 50 μL di Triton X-100.
  2. Preparare la soluzione di brefeldina A (BFA) sciogliendo la polvere di BFA in etanolo fino a una concentrazione finale di 10 mM (stock). Preparare la soluzione di wortmannin (Wm) sciogliendo la polvere di Wm in DMSO ad una concentrazione finale di 10 mM (stock).

2. Semina i semi.......

Representative Results

Uno studio precedente ha indicato che ERL1 è una chinasi recettore attiva che subisce eventi di traffico dinamico di membrana20. ERL1 è una chinasi transmembrana del recettore LRR sulla membrana plasmatica. L'ERL1 appena sintetizzato nel reticolo endoplasmatico viene elaborato nei corpi del Golgi e ulteriormente trasportato alla membrana plasmatica. Le molecole ERL1 sulla membrana plasmatica possono percepire i ligandi EPF usando il loro dominio LRR extracellulare18. Dopo.......

Discussion

Il sistema endomembrana separa il citoplasma di una cellula eucariotica in diversi compartimenti, che consente la funzione biologica specializzata di questi organelli. Per consegnare le proteine cargo e le macromolecole alla loro destinazione finale al momento giusto, numerose vescicole sono guidate per fare la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrana altamente regolamentati svolgono un ruolo fondamentale nella vitalità, nello sviluppo e nella crescita delle cellule. Il meccanismo che regola questo.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e dal Bronson Foundation Award (H.Z.) dell'Università dell'Arkansas per le scienze mediche (UAMS).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL syringesVWRBD309695Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)SigmaB7651membrane trafficking drug
Confocal MicroscopeLeicaLecia SP8 TCS with LAS-X software packageImaging
Dissecting ForcepsVWR82027-402Genetic cross
FijiNIHhttps://imagej.net/FijiImage processing
Leica LAS AF softwareLeicahttp://www.leica-microsystems.comImage processing
transgenic seeds of ERL1-YFPQi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)SigmaW1628membrane trafficking drug

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis a....

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