Metodi basati su immagini per studiare eventi di traffico di membrana in cellule di lignaggio stomatico

Summary

Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale.

Abstract

Nelle cellule eucariotiche, i componenti della membrana, comprese le proteine e i lipidi, vengono trasportati spaziotemporalmente a destinazione all'interno del sistema endomembrana. Ciò include il trasporto secretorio di proteine di nuova sintesi sulla superficie cellulare o all'esterno della cellula, il trasporto endocitico di carichi extracellulari o componenti della membrana plasmatica nella cellula e il riciclaggio o il trasporto di carichi tra gli organelli subcellulari, ecc. Gli eventi di traffico di membrana sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l'adattamento ambientale di tutte le cellule eucariotiche e, quindi, sono sottoposti a una regolamentazione rigorosa. Le chinasi recettoriali della superficie cellulare, che percepiscono i segnali del ligando dallo spazio extracellulare, subiscono sia il trasporto secretorio che quello endocitico. Gli approcci comunemente usati per studiare gli eventi di traffico di membrana utilizzando una chinasi recettoriale ricca di ripetizione leucina localizzata nella membrana plasmatica, ERL1, sono descritti qui. Gli approcci includono la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale. Per monitorare la regolazione spaziotemporale di ERL1, questo studio descrive l'analisi di co-localizzazione tra ERL1 e una proteina marcatrice del corpo multi-vescicolare, RFP-Ara7, l'analisi delle serie temporali di queste due proteine e l'analisi z-stack di ERL1-YFP trattata con gli inibitori del traffico di membrana brefeldina A e wortmannin.

Introduction

Il traffico di membrana è un processo cellulare conservato che distribuisce componenti di membrana (noti anche come carichi), tra cui proteine, lipidi e altri prodotti biologici, tra diversi organelli all'interno di una cellula eucariotica o attraverso la membrana plasmatica da e verso lo spazio extracellulare¹. Questo processo è facilitato da un insieme di membrane e organelli chiamati sistema endomembrana, che consiste nella membrana nucleare, nel reticolo endoplasmatico, nell'apparato di Golgi, nel vacuolo / lisosomi, nella membrana plasmatica e negli endosomi multipli¹. Il sistema endomembrana consente la modifica, i....

Protocol

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare la soluzione di sterilizzazione dei semi mescolando 15 ml di candeggina con 35 ml di acqua distillata e 50 μL di Triton X-100.
2. Preparare la soluzione di brefeldina A (BFA) sciogliendo la polvere di BFA in etanolo fino a una concentrazione finale di 10 mM (stock). Preparare la soluzione di wortmannin (Wm) sciogliendo la polvere di Wm in DMSO ad una concentrazione finale di 10 mM (stock).

2. Semina i semi.......

Discussion

Il sistema endomembrana separa il citoplasma di una cellula eucariotica in diversi compartimenti, che consente la funzione biologica specializzata di questi organelli. Per consegnare le proteine cargo e le macromolecole alla loro destinazione finale al momento giusto, numerose vescicole sono guidate per fare la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrana altamente regolamentati svolgono un ruolo fondamentale nella vitalità, nello sviluppo e nella crescita delle cellule. Il meccanismo che regola questo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug