Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

Summary

Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

Abstract

Em células eucarióticas, os componentes da membrana, incluindo proteínas e lipídios, são transportados espaço-temporalmente para seu destino dentro do sistema endomembrana. Isso inclui o transporte secretor de proteínas recém-sintetizadas para a superfície celular ou para o exterior da célula, o transporte endocítico de cargas extracelulares ou componentes da membrana plasmática para dentro da célula, e a reciclagem ou transporte de cargas entre as organelas subcelulares, etc. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental de todas as células eucarióticas e, portanto, estão sob regulamentação rigorosa. As quinases dos receptores de superfície celular, que percebem os sinais dos ligantes do espaço extracelular, sofrem transporte secretor e endocítico. Abordagens comumente usadas para estudar os eventos de tráfego de membrana usando uma quinase do receptor de leucina rica em repetição localizada na membrana plasmática, ERL1, são descritas aqui. As abordagens incluem preparação de material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais. Para monitorar a regulação espaço-temporal do ERL1, este estudo descreve a análise de co-localização entre ERL1 e uma proteína marcador de corpo multivesicular, RFP-Ara7, a análise de séries temporais dessas duas proteínas e a análise z-stack de ERL1-YFP tratadas com os inibidores de tráfego de membrana brefeldina A e wortmannina.

Introduction

O tráfego de membranas é um processo celular conservado que distribui componentes da membrana (também conhecidos como cargas), incluindo proteínas, lipídios e outros produtos biológicos, entre diferentes organelas dentro de uma célula eucariótica ou através da membrana plasmática de e para o espaço extracelular¹. Esse processo é facilitado por uma coleção de membranas e organelas denominada sistema endomembrana, que consiste na membrana nuclear, no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi, no vacúolo/lisossomos, na membrana plasmática e em múltiplos endossomos¹. O sistema de endomembrana permite a modificação, empac....

Protocol

1. Preparação das soluções

1. Preparar a solução de esterilização de sementes misturando 15 mL de água sanitária com 35 mL de água destilada e 50 μL de Triton X-100.
2. Preparar a solução de brefeldina A (BFA) dissolvendo o pó de BFA em etanol até uma concentração final de 10 mM (stock). Preparar a solução de wortmannin (Wm) dissolvendo o pó de Wm em DMSO até uma concentração final de 10 mM (stock).

2. Semeando as sementes

Discussion

O sistema de endomembrana separa o citoplasma de uma célula eucariótica em diferentes compartimentos, o que possibilita a função biológica especializada dessas organelas. Para entregar proteínas de carga e macromoléculas ao seu destino final no momento certo, inúmeras vesículas são guiadas para transportar entre essas organelas. Eventos de tráfico de membrana altamente regulados desempenham papéis fundamentais na viabilidade, desenvolvimento e crescimento das células. O mecanismo que regula esse processo cru.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug