Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь представлено несколько широко используемых методов для изучения событий мембранного транспорта рецепторной киназы плазматической мембраны. В этой рукописи подробно описаны протоколы, включающие подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации.

Abstract

В эукариотических клетках мембранные компоненты, включая белки и липиды, пространственно-временные транспортируются к месту назначения в пределах эндомембранной системы. Это включает в себя секреторный транспорт вновь синтезированных белков на поверхность клетки или снаружи клетки, эндоцитарный транспорт внеклеточных грузов или компонентов плазматической мембраны в клетку, а также рециркуляцию или перемещение грузов между субклеточными органеллами и т. д. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации к окружающей среде всех эукариотических клеток и, таким образом, находится под строгим регулированием. Рецепторные киназы клеточной поверхности, воспринимающие сигналы лигандов из внеклеточного пространства, подвергаются как секреторному, так и эндоцитарному транспорту. Здесь описаны широко используемые подходы к изучению событий мембранного транспорта с использованием рецепторной киназы ERL1, локализованной на плазматической мембране. Подходы включают подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации. Для мониторинга пространственно-временной регуляции ERL1 в данном исследовании описывается анализ колокализации между ERL1 и мультивезикулярным белком-маркером тельца, RFP-Ara7, анализ временных рядов этих двух белков и анализ z-стека ERL1-YFP, обработанного ингибиторами мембранного транспорта брефельдином А и вортманнином.

Introduction

Мембранный трафик представляет собой консервативный клеточный процесс, при котором компоненты мембраны (также известные как грузы), включая белки, липиды и другие биологические продукты, распределяются между различными органеллами внутри эукариотической клетки или через плазматическую мембрану во внеклеточноепространство и из него. Этому процессу способствует совокупность мембран и органелл, называемая эндомембранной системой, которая состоит из ядерной мембраны, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, вакуоли/лизосом, плазматической мембраны и множественных эндосом1. Эндомембранная система позволяет модифициро....

Protocol

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте раствор для стерилизации семян, смешав 15 мл отбеливателя с 35 мл дистиллированной воды и 50 мкл Triton X-100.
  2. Приготовьте раствор брефельдина А (БФА), растворив порошок БЖК в этаноле до конечной концентрации 10 мМ (исходное сырье). Пригот?.......

Representative Results

Предыдущее исследование показало, что ERL1 является активной рецепторной киназой, которая претерпевает динамические события мембранного транспорта20. ERL1 представляет собой трансмембранную LRR-рецепторную киназу на плазматической мембране. Вновь синтезированный ERL1 в эндопл.......

Discussion

Эндомембранная система разделяет цитоплазму эукариотической клетки на различные компартменты, что обеспечивает специализированную биологическую функцию этих органелл. Чтобы доставить белки и макромолекулы груза в конечный пункт назначения в нужное время, многочисленные везикулы п.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-2217757) (X.Q.) и Университетом медицинских наук Арканзаса (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL syringesVWRBD309695Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)SigmaB7651membrane trafficking drug
Confocal MicroscopeLeicaLecia SP8 TCS with LAS-X software packageImaging
Dissecting ForcepsVWR82027-402Genetic cross
FijiNIHhttps://imagej.net/FijiImage processing
Leica LAS AF softwareLeicahttp://www.leica-microsystems.comImage processing
transgenic seeds of ERL1-YFPQi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)SigmaW1628membrane trafficking drug

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis a....

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved