Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) dei topi sono uno strumento chiave per studiare la complessa biologia dei macrofagi tissutali. Come cellule primarie, modellano la fisiologia dei macrofagi in vivo più da vicino rispetto alle linee cellulari di macrofagi immortalizzate e possono essere derivate da topi già portatori di cambiamenti genetici definiti. Tuttavia, l'interruzione della funzione genica nei BMDM rimane tecnicamente impegnativa. Qui, forniamo un protocollo per l'editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei BMDM, che consente l'introduzione di piccole inserzioni e delezioni (indel) che si traducono in mutazioni frameshift che interrompono la funzione genica. Il protocollo descrive come sintetizzare RNA a guida singola (sgRNA-Cas9) e formare complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 purificati che possono essere rilasciati mediante elettroporazione. Fornisce inoltre un metodo efficiente per monitorare l'efficienza dell'editing utilizzando il sequenziamento Sanger di routine e un programma di analisi online disponibile gratuitamente. Il protocollo può essere eseguito entro 1 settimana e non richiede la costruzione di plasmidi; In genere si traduce in un'efficienza di editing dall'85% al 95%.