שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

Abstract

מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) מעכברים הם כלי מפתח לחקר הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים ברקמות. כתאים ראשוניים, הם מדגימים את הפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo באופן הדוק יותר מאשר שורות תאי מקרופאגים אימורטליים, וניתן לגזור אותם מעכברים שכבר נושאים שינויים גנטיים מוגדרים. עם זאת, שיבוש תפקוד הגנים ב- BMDM נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לעריכת גנום CRISPR/Cas9 יעילה ב- BMDM, המאפשר החדרה של החדרות ומחיקות קטנות (indels) הגורמות למוטציות frameshift המשבשות את תפקוד הגנים. הפרוטוקול מתאר כיצד לסנתז RNA מדריך יחיד (sgRNA-Cas9) וליצור קומפלקסים מטוהרים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) שניתן להעביר באמצעות אלקטרופורציה. הוא גם מספק שיטה יעילה לניטור יעילות העריכה באמצעות ריצוף Sanger שגרתי ותוכנית ניתוח מקוונת זמינה באופן חופשי. הפרוטוקול יכול להתבצע בתוך שבוע ואינו דורש בניית פלסמיד; התוצאה היא בדרך כלל יעילות עריכה של 85% עד 95%.

Introduction

מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקידים קריטיים בתיקון רקמות ובמערכת החיסון ^1,2. לקווי תאי מקרופאגים אימורטליים, כגון תאי עכבר RAW 264.7 או תאי THP-1 אנושיים, יש מספר מאפיינים מועילים, כולל צמיחה חזקה וקלות של שיבוש גנים על ידי העברת וקטורים להפרעות RNA או CRISPR/Cas9 ^3,4. עם זאת, טרנספורמציה אונקוגנית משנה באופן דרמטי את הפיזיולוגיה שלהם, מה שמביא להפעלה חריגה של מסלולים מסוימים ותגובות מושתקות של אחרים ^5,6. מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMDMs) דומים יותר לפיזיולוגיה של מקרופאגים

Protocol

1. תכנון sgRNA

הערה: שלב זה מתאר בחירה של רצפי היעד ועיצוב של sgRNAs. כדאי לתכנן מדריכים שנמצאים באקסון הקידוד הגדול הראשון, כך שכל חלבון מתורגם משתבש בשלב מוקדם במסגרת הקריאה הפתוחה. כדאי גם לבחור רצפי יעד שנמצאים באותו אקסון, מכיוון שזה ייעל את ניתוח יעילות העריכה (שלב 6). ה.......

Discussion

עריכת גנום באמצעות קומפלקסים חשמליים של Cas9-sgRNA מאפשרת שיבוש יעיל של תפקוד הגנים ב-BMDM. יעילות העריכה משתנה בהתאם לרצף היעד ולגן היעד. בדרך כלל, ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים בדרך כלל כדי לזהות אחד פעיל מאוד. לאתרים מסוימים יעילות עריכה נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מבנה הכרומטין. במקרים אלה, ניתן לבצע .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S