בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

Abstract

המחקר במבחנה של התמיינות אדיפוציט לבן, חום ובז' מאפשר לחקור פונקציות אוטונומיות תאיות של אדיפוציטים ומנגנוניהם. קווי תאים קדם-אדיפוציטיים לבנים אימורטליים זמינים לציבור ונמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, הופעתם של אדיפוציטים בצבע בז' ברקמת השומן הלבן בתגובה לרמזים חיצוניים קשה לשחזר את מלוא ההיקף באמצעות קווי תאי אדיפוציט לבנים הזמינים לציבור. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן מורין מבוצע בדרך כלל כדי להשיג preadipocytes ראשוני ולבצע התמיינות אדיפוציט. עם זאת, טחינה ועיכול collagenase של רקמת שומן ביד יכול לגרום לשינויים ניסיוניים נוטה לזיהום. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי שונה המשתמש בדיסוציאטור רקמות לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF, במטרה להפחית את השונות הניסיונית, להפחית את הזיהום ולהגדיל את יכולת השחזור. ניתן להשתמש בפראדיפוציטים המתקבלים ובאדיפוציטים מובחנים לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים.

Introduction

ביולוגיה של רקמת השומן מושכת תשומת לב הולכת וגוברת בגלל השכיחות הגוברת של השמנת יתר וסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם¹. אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה עודפת בצורה של טיפות שומנים, אשר משתחררים עם רעב. יתר על כן, רקמת השומן שומרת על הומאוסטזיס אנרגיה מערכתית על ידי משמש כאיבר אנדוקריני ותקשורת עם רקמות אחרות ^2,3. באופן מסקרן, גם עודף רקמת שומן (השמנת יתר) וגם אובדן שומן (ליפודיסטרופיה) קשורים לתנגודת לאינסולין ולסוכרת¹. אדיפוציטים מחולקים לשלושה סוגים: לבן, חום ובז'¹. אדיפוציטים לבנים מאחסנים בעיקר אנרגיה עודפת כשומנים, בעוד שאדיפוציטים חומים ובז' מפזרי....

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוקיו ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת טוקיו.

1. הכנת תמיסת אנזים ומדיום

1. שים את שני הצדדים של רקמת שומן לבן מפשעתי (צד ימין וצד שמאל.......

Discussion

כאן, תיארנו פרוטוקול לבידוד של SVF מרקמת שומן מורין כדי לקבל preadipocytes ולבצע התמיינות אדיפוציט במבחנה. השימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז הפחית את השונות הניסיונית, הפחית את הסיכון לזיהום והגדיל את יכולת הרבייה. בעוד הליך זה הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול המוצג, התהליך הוא אוטומטי מא?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056