Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Summary

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Abstract

O estudo in vitro da diferenciação de adipócitos brancos, marrons e beges permite a investigação das funções autônomas celulares dos adipócitos e seus mecanismos. Linhagens celulares de pré-adipócitos brancos imortalizadas são publicamente disponíveis e amplamente utilizadas. No entanto, a emergência de adipócitos beges no tecido adiposo branco em resposta a pistas externas é difícil de recapitular em toda a extensão usando linhagens de células de adipócitos brancos disponíveis publicamente. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é comumente realizado para obtenção de pré-adipócitos primários e diferenciação de adipócitos. No entanto, a picagem e digestão manual do tecido adiposo pela colagenase pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação. Apresentamos um protocolo semi-automatizado modificado que utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase para facilitar o isolamento da FVS, com o objetivo de reduzir a variação experimental, reduzir a contaminação e aumentar a reprodutibilidade. Os pré-adipócitos e adipócitos diferenciados obtidos podem ser utilizados para análises funcionais e mecanísticas.

Introduction

A biologia do tecido adiposo tem atraído cada vez mais atenção devido à crescente prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 em todo o^mundo1. Os adipócitos armazenam energia em excesso na forma de gotículas lipídicas, que são liberadas após a fome. Além disso, o tecido adiposo mantém a homeostase energética sistêmica por servir como órgão endócrino e se comunicar com outros tecidos ^2,3. Curiosamente, tanto o excesso de tecido adiposo (obesidade) quanto a perda adiposa (lipodistrofia) estão ligados à resistência à insulina e ao diabetes¹. Os adipócitos são dividid....

Protocol

Todos os experimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Tóquio.

1. Preparação da solução enzimática e do meio

1. Colocar ambos os lados do tecido adiposo branco inguinal (lado direito e esquerdo, aproximadamente 150 mg) de um camundongo de 7-8 semanas de idade e 2,5 mL de solução.......

Discussion

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de isolamento da FVS do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de dissociador tecidual para digestão da colagenase diminuiu a variação experimental, diminuiu o risco de contaminação e aumentou a reprodutibilidade. Embora esse procedimento seja uma etapa crítica dentro do protocolo apresentado, o processo é altamente automatizado e a otimização não é necessária. No entanto, dependendo da idade .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056