نعترف بنوح جوزيف (قسم الهندسة الحيوية الشمالية الشرقية) لتصنيع الألواح النحاسية.

Constructing and Operating a Cooling Stage to Immobilize C. elegans En Masse

<ol>
	<li>Wearne, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+imaging,+digitization+and+analysis+of+three-dimensional+neural+morphology+on+multiple+scales.">New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales.</a> Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).</li><li>Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+image+enhancement+for+tracing+3D+morphologies+of+neurons+and+brain+vasculatures.">Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures.</a> Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+techniques+for+imaging+membrane+topography.">Optical techniques for imaging membrane topography.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).</li><li>Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+membrane+structural+dynamics+of+fusion+and+endocytosis+with+advanced+light+imaging+techniques.">Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques.</a> Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).</li><li>Chen, Y., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two-photon+excitation+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+for+protein+localization.">Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).</li><li>Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+living+cells+and+tissues+using+FRET+and+FLIM.">Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM.</a> Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy-tips+and+tools.">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hobert, O., Loria, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+of+GFP+in+Caenorhabditis+elegans.">Uses of GFP in Caenorhabditis elegans.</a> Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols. 47, 203-226 (2005).</li><li>Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analyzing+neuronal+structure+and+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 218 (4), (2021).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DLK-independent+neuronal+regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+shares+links+with+activity-dependent+ectopic+outgrowth.">Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Pintard, L., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+cell+division+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nature Communications. 2, 271 (2011).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li><li>Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+submicron-resolution+microscopy+of+Caenorhabditis+elegans+populations+under+strong+immobilization+by+cooling+cultivation+plates.">High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates.</a> iScience. 26 (2), 105999 (2023).</li><li>Zhao, D., Tan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+thermoelectric+cooling:+Materials,+modeling+and+applications.">A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications.</a> Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

تظهر مرحلة التبريد التصنيع والتجميع والاستخدام في هذه المخطوطة. معظم المكونات هي عناصر جاهزة يمكن شراؤها عبر الإنترنت. بعض المكونات ، مثل الصفيحة النحاسية ونافذة الياقوت ، تحتاج إلى طلب مخصص وقد يستغرق تصنيعها ما يصل إلى 1 شهر. المكونات الأخرى التي يمكن طباعتها 3D يتم تصنيعها بسهولة في معظم المؤسسات البحثية (الجدول التكميلي 1). تحتاج عملية التجميع إلى عدد قليل من الأدوات ويمكن القيام بها بسرعة بواسطة غير خبير في غضون ساعات قليلة. وبالتالي ، يجب أن تكون معظم المختبرات البيولوجية قادرة على تنفيذ هذا الجهاز بسهولة.
تمتلك مرحلة التبريد ونهج تجميد التبريد العديد من التحسينات المهمة على طرق التثبيت الحالية ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي20. باختصار ، تتيح مرحلة التبريد الشلل القوي لمجموعات كبيرة من C. elegans من جميع الأعمار ، بما في ذلك الأجنة والداور ، على لوحات الاستزراع النموذجية الخاصة بهم تحت سير عمل الفحص المجهري القياسي. إنه يلغي الحاجة إلى إعدادات الأجهزة المعقدة ، مثل الموائع الدقيقة ، مع توفير تأثير تثبيت أقوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من التعرض الكيميائي السام المحتمل للحيوانات والباحثين حيث لا يتم استخدام أي مواد كيميائية ، مع توفير تأثير تثبيت مماثل. تتيح هذه القدرات التقنية التطبيق الواسع لهذا الجهاز والنهج للعديد من التجارب التي تتطلب فحصا مجهريا عالي الدقة في الجسم الحي على أعداد كبيرة من الحيوانات.
هناك بعض الخطوات الحاسمة أثناء بناء الجهاز ، بما في ذلك جميع تطبيقات المعجون الحراري والشريط العريض لتثبيت نافذة الياقوت على لوحة كوبر. يضمن المعجون الحراري موصلية حرارية قوية عن طريق استبدال الفجوات بمادة مقاومة حرارية منخفضة. لتحقيق أداء التبريد المطلوب ، يجب إدخال العجينة بشكل صحيح بين جميع الأسطح المتاخمة / الملامسة ، بما في ذلك سطح بلتيير البارد إلى الصفيحة النحاسية ، وسطح بلتيير الساخن إلى كتلة التبريد النحاسية ، واللوحة النحاسية إلى نافذة الياقوت. الشريط العريض المطبق على المسرح يعزل الصفيحة النحاسية لمنع التسخين من الهواء والتكثيف ، مما يؤدي إلى الصدأ. كما أنه يقوي الاتصال بين نافذة الياقوت واللوحة النحاسية. وبالتالي ، فإن تطبيق المعجون الحراري والشريط العريض يتطلب عناية إضافية.
في تجربة تجميد التبريد الفعلية ، تعتمد المعلمات الواردة في هذه المخطوطة ، مثل الفولتية والأوقات ، على الخصائص المحددة لألواح الزراعة والمرحلة ، مثل كمية الآجار في الألواح ، وكفاءة المرحلة ، ودرجة الحرارة المحيطة والرطوبة. في التعديلات المستقبلية ، يمكن تثبيت وحدة تحكم التغذية المرتدة ، مثل مشتق التكامل النسبي (PID) ، لضبط إدخال الجهد بنشاط على مرحلة التبريد لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة وتثبيتها.
هناك العديد من القيود على تجميد مرحلة التبريد هذه ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي20. باختصار ، يتم تجميد الحيوانات التي يتم تربيتها في درجات حرارة مختلفة بدرجات مختلفة ، والتي قد تحتاج إلى ضبط إضافي. أيضا ، لم يتم تصميم مرحلة التبريد الحالية هذه للمجهر المقلوب. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التصوير أو الفحص على صفيحة الزراعة مباشرة إلى تلوث اللوحة.
نحن نصمم إصدارات جديدة من مرحلة التبريد مناسبة لمنصات التصوير المختلفة ، بما في ذلك المجاهر المستقيمة المركبة والمجاهر المقلوبة. ستسمح هذه التصميمات الجديدة بتثبيت تبريد الحيوانات مباشرة على لوحات الاستزراع أثناء التصوير على هذه المنصات. سيستخدم التصوير في مراحل التبريد هذه أهداف غمر الهواء لمسافات طويلة ، على غرار التكوين الرأسي. في الوقت الحاضر ، يمكن أن يكون لأهداف الغمر في الهواء فتحة عددية تصل إلى 0.9 ، والتي توفر دقة حوالي 300 نانومتر لتصوير البروتين الفلوري الأخضر. وبالتالي ، فإن الجمع بين مرحلة التبريد الجديدة والمجهر يمكن أن يسمح بتصوير مضان بدقة دون الميكرون بشكل روتيني.
كما نقدم بعض النصائح المفيدة لاستخدام مرحلة التبريد وفقا لتجربتنا. على سبيل المثال ، يجب على الأفراد التحقق مما إذا كانت هناك أي فقاعات هواء داخل مجموعة تبريد المياه. تعمل فقاعات الهواء على تدهور التبريد إلى سطح بلتيير الساخن وبالتالي تقلل من فعالية التبريد لمرحلة التبريد. في حالة وجود فقاعات هواء ، يجب تشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لجعل تدفق المياه واهتزاز جميع مكونات تدفق المياه. يمكن طرد فقاعات الهواء من المناطق المحاصرة وتنفيسها بواسطة خزان المضخة. يجب على الباحثين التأكد من عدم ثني أنابيب تدفق المياه أو تقاطعها عند تجميع مجموعة تبريد المياه. قد يمنع ثني الأنبوب أو عبوره التدفق الكافي للمياه ويقلل من فعالية التبريد. يجب أن تكون وصلات الأنبوب مناسبة وضيقة بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام أنبوب ناعم بقطر مختلف بدلا من ذلك لضمان ضيق. لا ينبغي تطبيق اللصق ، حتى لو لم يكن الاتصال ضيقا بدرجة كافية ، حيث قد يؤدي اللصق إلى انسداد أثناء الاستخدام في المستقبل. تؤثر رطوبة الغرفة على أداء التبريد وتدخل التكثيف والجليد في مرحلة التبريد. قبل وضع صفيحة الزراعة على مرحلة التبريد ، يوصى باستخدام منديل ورقي لإزالة التكثيف أو استخدام غرفة التبريد لإزالة الجليد الذي تشكل على نافذة الياقوت بسرعة. يمكن أن يتسبب خزان المضخة ومراوح المبرد في اهتزازات صغيرة في المجهر إذا كانا يعملان على نفس الطاولة. اهتزاز المجهر يطمس الصورة المكتسبة وبالتالي يجب تجنبه. يمكن استخدام وسادة لعزل الخزان والرادياتير ميكانيكيا ، أو يمكن وضعها على طاولة منفصلة قريبة. يمكن أن تصبح مرحلة التبريد مرحلة تسخين عن طريق عكس التوصيل الكهربائي إلى بلتيير.

يوفر الفحص المجهري البصري عالي الدقة أداة لا غنى عنها لدراسة الهياكل البيولوجية في الجسم الحي على المستوى دون الخلوي. تتطلب العديد من الدراسات البيولوجية تصويرا بدقة دون الميكرون لحل التفاصيل التشريحية الدقيقة ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية1،2 ، وبنية الغشاء3،4 ، وتوطين البروتين5،6. تتطلب الصورة عالية الدقة وقت تعرض من عدة أجزاء من الثانية إلى ثوان ، اعتمادا على طريقة التصوير والمسبار 7,8. لتحقيق أفضل النتائج ، من الضروري تخطيط وإجراء التجارب القائمة على الفحص المجهري بعناية. من الأمور الحاسمة في هذا الجهد طريقة فعالة لإعداد الحيوانات تسهل التصوير عالي الدقة.
الديدان الخيطية C. elegans هي كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية9. يزرع هذا الحيوان الصغير عادة على ألواح أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) ، ويتكاثر بسرعة عن طريق الإخصاب الذاتي ، مما يجعله مناسبا تماما للدراسات واسعة النطاق. تسمح شفافيتها ومجموعة واسعة من تقنيات وضع العلامات بالتصور المباشر لتشريحها الداخلي10,11. تعتبر الهياكل الدقيقة في C. elegans مثالية لدراسة العمليات البيولوجية على المستوى تحت الخلوي ، مثل تجديد الخلايا العصبية12 ، وتنكس الخلاياالعصبية 13 ، وانقسام الخلايا14. تتطلب مثل هذه الدراسات التصوير بدقة دون الميكرون وتثبيت الحيوان بقوة كافية لمنع ضبابية الصورة. يعد التثبيت القوي أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص للتقنيات التي تتضمن صورا متعددة في المكان أو الزمان ، مثل مكدسات الصور 3D (أي مكدسات z) والتصوير بفاصل زمني. أي حركة حيوانية بين التعرضات يمكن أن تحجب النتيجة. بالنسبة إلى C. elegans ، يتضمن التثبيت القوي عادة التلاعب اليدوي بالحيوانات الفردية وتركيبها على شرائح باستخدام مخدر15,16. هذه الإجراءات كثيفة الوقت والعمالة تجعل التجارب واسعة النطاق صعبة للغاية. يمكن لاستراتيجية الشلل حيث يتم تجميد الحيوانات بشكل مباشر وعكسي على ألواح الزراعة الأصلية أن تتيح تصويرا عالي الإنتاجية عالي الدقة.
تم عرض تجميد تبريد C. elegans في عدد قليل من الدراسات ولكن لا يتم استخدامه على نطاق واسع. عادة ما يتم دمجه مع جهاز الموائع الدقيقة لزيادة تقييد الحيوانات17،18،19. ومع ذلك ، فإن أجهزة الموائع الدقيقة معقدة ، وتتطلب تدريبا تشغيليا كبيرا ، ولا يمكن دمجها بسهولة مع سير عمل الزراعة الصلبة النموذجية لتجارب C. elegans. وبالتالي ، لا يتم استخدام الموائع الدقيقة على نطاق واسع لتجميد C. elegans. يظهر هنا ، بالتزامن مع المنشور الأخير لمختبرتشونغ 20 ، إدخال نهج جديد لتجميد التبريد باستخدام مرحلة التبريد الكهروحرارية (الشكل 1) لمعالجة أوجه القصور هذه. مع مرحلة التبريد ، يمكن تبريد لوحة زراعة البوليسترين النموذجية 60 مم إلى أي درجة حرارة مستهدفة (مجموعة T) بين -8 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن لنهج مرحلة التبريد هذا أن يجمد مجموعة كاملة من الحيوانات بسهولة وعكس ذلك بأقل جهد للمستخدم ، مما يلغي 98٪ من وقت معالجة الحيوانات20.
أدناه ، يتم وصف إجراءات بناء مرحلة التبريد من الصفر. باستثناء تصنيع الأجزاء والطباعة ثلاثية الأبعاد ، من المتوقع أن يستغرق الإجراء بأكمله 4 ساعات دون الحاجة إلى أدوات أو خبرات خاصة. بعد ذلك ، يتم وصف ثلاث استراتيجيات تبريد مختلفة بمعدلات تبريد متفاوتة وجهود المستخدم لشل حركة C. elegans على مجهر عمودي نموذجي. قد تعتمد الإستراتيجية المفضلة على تطبيق المستخدم. يتم وصف بروتوكولات استراتيجيات تجميد التبريد الثلاث هذه بالتفصيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-V power supply</td>
			<td>ANYTITI</td>
			<td>ledpower00</td>
			<td>output DC 12V +/-0.5V, 5A 
			power 60W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 screw</td>
			<td>arbitrary</td>
			<td></td>
			<td>for bracket fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bracket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>breadboard</td>
			<td>DEYUE</td>
			<td>7545924028</td>
			<td>400 pin solderless board kit for DIY electric connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper cooling block</td>
			<td>Kalolary</td>
			<td>Kalolary-Heatsink001</td>
			<td>40*40mm 
			internal fin thickness 0.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper plate</td>
			<td>arbitrary</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. &#160;See supplementary for 2D drawing for manufacturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital thermocouple thermometer</td>
			<td>Proster</td>
			<td>4333090752</td>
			<td>dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes 
			measuring range -50-300&#176;C 
			accuracy &#177;1.5% 
			resolution 0.1&#176;C /&#176;F &#60; 1000&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isolation base</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jumper wires</td>
			<td>arbitrary</td>
			<td></td>
			<td>for electronic connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage peltier</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>TEC1-12706</td>
			<td>thermoelectric cooling device 
			size 40*40*7.05 mm 
			Umax 16.1 V&#160; 
			Imax 8.5 A 
			&#916;Tmax @ Th 85&#176;C @ 27&#176;C 
			Qmax @ Th 51.6W @ 27&#176;C 
			resistance 1.65 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>14-176-332E</td>
			<td>ultrasoft tube 
			durometer hardness Shore A, 50 
			inner diameter 1/4 in 
			outer diameter 9.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>packaging tape</td>
			<td>arbitrary</td>
			<td></td>
			<td>4 inch wide to cover the copper plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump tank</td>
			<td>Yosoo</td>
			<td>SC-300T</td>
			<td>input power DC 12V 
			flow rate 300L/h max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>radiator</td>
			<td>DIYhzWater</td>
			<td>10463</td>
			<td>12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sapphire window</td>
			<td>Altos Photonics, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Contact Altos for custom order 
			size &#216; 80mm, 3mm thick 
			surface quality 60-40s/d 
			uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal paste</td>
			<td>Corsair</td>
			<td>XTM50</td>
			<td>reduce thermal impedance between surfaces 
			thermal conductivity 5.0W/mK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tunable power supply</td>
			<td>Kungber</td>
			<td>DY-SPS3010B</td>
			<td>voltage range 0 &#8211; 30V 
			current range 0 &#8211; 10A 
			linear Power Supply with 4-Digits 
			coarse and fine adjustments with alligator leads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and operation of a cooling stage to immobilize c. elegans on their culture plates

يمكن أن تكشف طرق الفحص المجهري عالية الدقة في الجسم الحي عن معلومات دقيقة وتفاصيل دقيقة داخل الحيوان النموذجي Caenorhabditis elegans (C. elegans) ، ولكنها تتطلب تجميدا قويا للحيوان لمنع ضبابية الحركة في الصور. لسوء الحظ ، تتطلب معظم تقنيات التثبيت الحالية جهدا يدويا كبيرا ، مما يجعل التصوير عالي الدقة منخفض الإنتاجية. يتم تبسيط تجميد C. elegans إلى حد كبير باستخدام نهج التبريد الذي يمكن بسهولة شل حركة مجموعات بأكملها مباشرة على لوحات الزراعة الخاصة بهم. يمكن لمرحلة التبريد إنشاء والحفاظ على نطاق واسع من درجات الحرارة مع توزيع موحد على لوحة الزراعة. في هذه المقالة ، يتم توثيق العملية الكاملة لبناء مرحلة التبريد. الهدف هو أن الباحث النموذجي يمكنه بناء مرحلة تبريد تشغيلية في مختبره باتباع هذا البروتوكول دون صعوبة. يظهر استخدام مرحلة التبريد باتباع ثلاثة بروتوكولات ، ولكل بروتوكول مزايا لتجارب مختلفة. يظهر أيضا مثال على ملف تعريف التبريد للمرحلة مع اقترابها من درجة حرارتها النهائية وبعض النصائح المفيدة في استخدام تثبيت التبريد.

High-resolution optical microscopy provides an indispensable tool for studying in vivo biological structures at the subcellular level. Many biological studies require submicron resolution imaging to resolve subtle anatomical details, including neuron morphology1,2, membrane structure3,4, and protein localization5,6. A high-resolution image requires an exposure time of several milliseconds to seconds, depending on the imaging modality and probe7,8. To achieve optimal results, it is essential to carefully plan and conduct microscopy-based experiments. Crucial to this effort is an efficient animal preparation method that facilitates high-resolution imaging.
The nematode C. elegans is a widely utilized model organism for studying many biological processes9. This small animal is typically cultivated on nematode growth medium (NGM) agar plates, and they reproduce rapidly by self-fertilization, making them well-suited for large-scale studies. Their transparency and a wide array of labeling techniques allow the straightforward visualization of their internal anatomy10,11. The fine structures in C. elegans are ideal for studying biological processes at the subcellular level, such as neuron regeneration12, neuron degeneration13, and cell division14. Such studies necessitate imaging at submicron resolution and animal immobilization strong enough to prevent image blur. Strong immobilization is especially crucial for techniques involving multiple images in space or time, such as 3D image stacks (i.e., z-stacks) and time-lapse imaging. Any animal movement between the exposures can obscure the result. For C. elegans, strong immobilization typically involves manual manipulation of individual animals and mounting them on slides with an anesthetic15,16. These time- and labor-intensive procedures make large-scale experiments very difficult. An immobilization strategy where animals are directly and reversibly immobilized on their original cultivation plates could enable high-throughput high-resolution imaging.
Cooling immobilization of C. elegans has been shown in a few studies but is not widely utilized. It is usually combined with a microfluidic device to further restrain animals17,18,19. However, microfluidic devices are complex, require significant operational training, and cannot be easily integrated with typical solid cultivation workflows of C. elegans experiments. Thus, microfluidics are not widely utilized for C. elegans immobilization. Presented here, in conjunction with the Chung Laboratory&#39;s recent publication20, is the introduction of a new cooling immobilization approach using a thermoelectric cooling stage (Figure 1) to address these shortcomings. With the cooling stage, a typical 60 mm polystyrene cultivation plate can be cooled down to any target temperature (Tset) between -8 &#176;C to room temperature. This cooling stage approach can readily and reversibly immobilize an entire animal population with minimal user effort, eliminating 98% of the animal processing time20.
Below, the procedures for building a cooling stage from scratch are described. Except for the machining of parts and 3D printing, the whole procedure is expected to take 4 h without the requirement of special tools or expertise. Then, three different cooling strategies with varying cooling rates and user efforts to immobilize C. elegans on a typical upright microscope are further described. The preferred strategy may depend on the user application. The protocols for those three cooling immobilization strategies are described in detail.

Author Spotlight: Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates  

تجميع وتشغيل مرحلة التبريد لشل حركة C. elegans على لوحات الاستزراع الخاصة بهم

قياس درجة حرارة التبريد بالنسبة لتجارب تجميد التبريد الأولية ، من المهم تتبع درجة حرارة سطح أجار لضمان إمكانية تجميد الحيوانات بشكل صحيح. يمكن للتجارب المستقبلية التي يتم تكرارها من التجربة الأولية استخدام نفس المعلمات ، عادة دون تتبع درجة الحرارة بشكل متكرر. لقياس درجة الحرارة ، يتم تعقيم طرف الترمومتر المزدوج الحراري باستخدام محلول إيثانول بنسبة 70٪ ، في انتظار أن يتبخر الإيثانول تماما قبل الاستخدام. بعد ذلك ، يتم إدخال طرف المزدوجة الحرارية 1 مم في أجار NGM لضمان قراءة دقيقة لدرجة الحرارة. يتم تثبيت طرف مقياس الحرارة باستخدام حامل مشبك أو حوامل أخرى (الشكل 7 ب).
قياس درجة الحرارة بكاميرا الأشعة تحت الحمراء تم تصميم مرحلة التبريد لضمان توزيع درجة الحرارة في المنطقة المركزية التي يبلغ قطرها 40 مم للوحة بشكل موحد. يتم استخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء التطلعية (FLIR) لتصوير توزيع درجة الحرارة على سطح أجار. يبلغ الحد الأقصى لفرق درجة الحرارة حوالي 1 درجة مئوية عندما تكونمجموعة T 1 أو 3 أو 6 درجات مئوية (الشكل 8 أ).
تقييم معدل التبريد باستخدام استراتيجية التبريد السريع تستخدم استراتيجية التبريد السريع لتوصيف معدل التبريد لمرحلة عند 12 فولت. يتم وضع لوحة 20 درجة مئوية في مرحلة التبريد ويتم استخدام مقياس حرارة مزدوج حراري لتتبع درجة حرارة السطح. تبرد المرحلة ألواح 20 درجة مئوية إلى 6 درجات مئوية في 6 دقائق ، إلى 1 درجة مئوية في 10 دقائق ، وتستقر في النهاية أقل من -7 درجة مئوية في حوالي 40 دقيقة (الشكل 8 ب).
استخدام مرحلة التبريد على منصة مجهر عمودية يشتمل المجهر المستقيم عادة على هدف للتصوير ، ومرحلة لحمل العينات ، والإضاءة. تم تصميم مرحلة التبريد هذه للاستخدام في مرحلة المجهر المستقيم النموذجية مع سهولة الإدخال والإزالة (الشكل 8C). عندما تكون هناك حاجة إلى تجميد التبريد للتصوير أو الفحص ، يتم وضع مرحلة التبريد ببساطة على مرحلة المجهر لإنهاء القسط والعكس صحيح.
يظهر تجميد الديدان على لوحة التبريد في الفيلم 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig01.jpg"> الشكل 1: نموذج 3D لجهاز مرحلة التبريد. لا يتم عرض الاتصالات الإلكترونية من أجل الوضوح. يضخ الخزان الماء عبر كتلة التبريد لإزالة الحرارة المنقولة بواسطة بلتيير المضمنة في المسرح. يمكن وضع صفيحة زراعة البوليسترين النموذجية مقاس 60 مم على نافذة الياقوت الشفافة وتبريدها حسب المرحلة. نموذج تم إنشاؤه في سوليدووركس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig02.jpg"> الشكل 2: نماذج 3D للمكونات المراد تصنيعها. أ: صفيحة نحاسية. (ب) قوس عقد مطبوع 3D. (C) لوحة عزل مطبوعة 3D. النماذج التي تم إنشاؤها في سوليدووركس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig03.jpg"> الشكل 3: تجميع تبريد الماء . (أ) المكونات الفردية. أنابيب مقطوعة لأطوال محددة. (ب) توصيل مكونات التبريد بالماء. (ج) الأسلاك التي تربط خزان المضخة والرادياتير بمصدر الطاقة 12 فولت. بشكل عام ، تتصل الأسلاك الحمراء بالطرف الموجب ، والأسلاك السوداء بالطرف السالب. د: سكب الماء النقي في المضخة. (ه) امتلأ الخزان إلى أكثر من الثلثين لتحقيق الكفاءة المثلى للمضخة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig04.jpg"> الشكل 4: توصيل بلتيير ومجموعة تبريد المياه. (أ) مكونات لتشغيل بلتيير. (ب) استخدام مصدر الطاقة القابل للضبط لتحديد الجوانب الساخنة والباردة لبلتيير. للسلامة ، لا يتم استخدام أكثر من 2 فولت. (ج) تطبيق معجون حراري متساو على سطح كتلة النحاس. (د) تطبيق معجون حراري متساو على سطح بلتيير الساخن. (ه) الجانب الساخن من بلتيير مضغوط على الكتلة النحاسية بعجينة حرارية. (F) مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء المستخدم لقياس درجة حرارة سطح بلتيير البارد. من الناحية المثالية ، يمكن أن تصل درجة الحرارة الباردة إلى ما يقرب من -35 درجة مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig05.jpg"> الشكل 5: تجميع الصفيحة النحاسية ونافذة الياقوت . (أ) المكونات المطلوبة. (ب) معجون حراري يوضع على ثلاثة أسطح داخلية للوحة النحاسية حيث ستتلامس نافذة الياقوت. منظران لأسفل للوحة النحاسية يوضحان موقع الأسطح الثلاثة. (ج) نافذة من الياقوت في فتحة الصفيحة النحاسية. (د) شريط لاصق على السطح العلوي للتجميع. (ه) الجانب العلوي: تشير الخطوط الزرقاء المتقطعة إلى مواقع قطع الشريط وإزالته: انخفاض مربع ، فتحتان ، ومنطقة ياقوت قطرها 70 مم. (F) الجانب السفلي: يتم قص الشريط وإزالته كما هو موضح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig06.jpg"> الشكل 6: التجميع النهائي لمرحلة التبريد. أ: عجينة حرارية مطبقة على انخفاض الصفيحة النحاسية. (ب) معجون حراري يوضع على الجانب البارد من بلتيير. (ج) السطح البارد لبلتيير المتصل بالمنخفض. (د) كتلة تبريد نحاسية مثبتة على الصفيحة النحاسية باستخدام البراغي. مرحلة التبريد في قاعدة العزل. (ه) مرحلة التبريد المكتملة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig07.jpg"> الشكل 7: مرحلة التبريد على المجهر وقياس المزدوجة الحرارية. أ: مرحلة التبريد الموضوعة على قاعدة المجهر للتصوير. نافذة الياقوت شفافة ، مما يسمح بالإضاءة. (ب) ترمومتر مزدوج حراري يستخدم لقياس درجة حرارة سطح أجار NGM. يتم إدخال الطرف حوالي 1 مم في أجار NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig08.jpg"> الشكل 8: توصيف مرحلة التبريد واستخدامها . (أ) صور حرارية توضح سطح الآجار المبرد إلى 1 و3 و6 درجات مئوية. توزيع متساو لدرجة الحرارة داخل المنطقة المركزية 40 مم (دائرة بيضاء متقطعة). (ب) درجة حرارة سطح أجار NGM بمرور الوقت في مرحلة التبريد عند 12 فولت. يمكن تبريد سطح أجار NGM أقل من -7 درجة مئوية. درجة الحرارة تقاس بالطريقة الموضحة في الشكل 7 ب. (ج) مرحلة التبريد المستخدمة على مجهر عمودي نموذجي. يمكن تركيب مرحلة التبريد أو إزالتها بسهولة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>التبريد البطيء</td>
			<td>تبريد سريع</td>
			<td>التبريد المفاجئ</td>
		</tr><tr><td>احتلال المرحلة</td>
			<td>الحد الادني</td>
			<td>طويل</td>
			<td>متوسط</td>
		</tr><tr><td>الوقت حتى يتم تجميد الحيوانات</td>
			<td>طويل</td>
			<td>متوسط</td>
			<td>قصير جدا</td>
		</tr><tr><td>قوة الشلل</td>
			<td>قوي</td>
			<td>متوسط</td>
			<td>متوسط</td>
		</tr><tr><td>جهد المستخدم</td>
			<td>الحد الادني</td>
			<td>أكثر بقليل من الحد الأدنى</td>
			<td>الحد الاقصي</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: مقارنة استراتيجيات التبريد.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مجموعة T (°C)</td>
			<td>ΔT (درجة مئوية)</td>
			<td>مجموعة V (V)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7.4</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>4.5</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>5.5</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>5.9</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>5.5</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: المعلمات لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة في استراتيجية التبريد السريع.
الملف التكميلي 1: صفيحة نحاسية بالمتري. رسم A2D لتصنيع الألواح النحاسية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Copper%20plate%20in%20Metric.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: حامل القابضة. رسم ثلاثي الأبعاد لقوس عقد يمكن فتحه أو تعديله بواسطة Solidworks وتصديره إلى برنامج طباعة ثلاثي الأبعاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/holding%20bracket.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: لوحة العزل. رسم ثلاثي الأبعاد للوحة عزل يمكن فتحها أو تعديلها بواسطة Solidworks وتصديرها إلى برنامج طباعة ثلاثي الأبعاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/isolation%20plate.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الفيلم 1: فيديو التبريد. ديدان التثبيت على صفيحة أجار NGM عند 2 درجة مئوية. تم تبريد اللوحة من درجة حرارة الغرفة إلى 2 درجة مئوية ، وبقيت عند 2 درجة مئوية لعدة دقائق. بعد ذلك ، تم إيقاف تشغيل مرحلة التبريد وبدأت الألواح في التسخين إلى درجة حرارة الغرفة بشكل طبيعي. يتم تسريع الفيديو بمقدار 10x ليناسب فيديو 1 ساعة في 6 دقائق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Cooling%20video.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الجدول التكميلي 1: تقدير السعر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates at JoVE.com

تصف هذه الورقة بروتوكولات لبناء وتشغيل مرحلة تبريد لشل حركة C. elegans على ألواح الزراعة الأصلية بشكل جماعي.

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

نحن نعمل على تطوير نهج بسيط يمكنه شل حركة جميع سكان Caenorhabditis elegans مباشرة على أطباق الزراعة. تعمل هذه الاستراتيجية على تسريع التجارب المتعلقة بالتصوير بشكل كبير. إن تثبيت أزيد الصوديوم المستخدم عادة للتصوير عالي الدقة لسكان C.elegans كثيف العمالة للغاية ، ويتطلب تركيب الحيوانات الفردية والتعامل معها.يمكن أن تقلل هذه الطريقة أيضا من عمر الحيوان وقدرته على البقاء ، مما قد يؤدي إلى إرباك البيانات. تستخدم طريقة التبريد التقليدية درجات حرارة منخفضة نسبيا من درجتين إلى أربع درجات مئوية من السوائل الدقيقة المستخدمة ، الأمر الذي يتطلب تدريبا مكثفا للمستخدم. وجدنا أنه مع مرحلة التبريد ، فإن درجات الحرارة الدافئة مثل ست درجات مئوية ، تشل حركة الحيوانات بقوة أكبر لتصوير الثورة العالية.لا يتم استخدام تجميد تبريد C.elegans على نطاق واسع ولكن عند استخدامه ، عادة ما يتم دمجه مع الموائع الدقيقة المعقدة التي تتطلب تدريبا كبيرا للمستخدم. نظرا لقصور منهجية التثبيت النموذجية ، فإن تحسيننا لتعبئة التبريد وإمكانية الوصول يتيح إنتاجية عالية وتصويرا عالي الدقة للباحثين. بالمقارنة مع التركيب كثيف العمالة وتخدير الحيوانات الفردية ، يمكن لنهج التبريد لدينا أن يجمد بشكل عكسي مجموعات كبيرة من C.elegans ، مما يلغي 98٪ من وقت المعالجة.كما يقلل نقص التخدير الكيميائي من التعرض الضار للحيوانات والباحثين. تسمح مرحلة التبريد بإنتاجية عالية وتصوير عالي الدقة مباشرة على ألواح الزراعة. تمكن بساطة هذا التصميم الباحثين الآخرين من بناء أجهزتهم الخاصة بسهولة ودمجها في إعداداتهم الحالية ، لإحداث ثورة في نطاق ووتيرة دراساتهم البيولوجية.سيقوم مختبرنا بتكييف مرحلة التبريد لتكوينات المجهر المختلفة. ستعمل التصميمات المختلفة مع المجاهر المقلوبة والمجاهر المستقيمة المركبة بالإضافة إلى منصات التصوير المختلفة.