Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) frigives af neutrofiler som et svar på bakteriel infektion eller traumatisk vævsskade, men spiller også en rolle i autoimmune sygdomme og steril inflammation. De er weblignende strukturer sammensat af dobbeltstrengede DNA-filamenter, histoner og antimikrobielle proteiner. Når de er frigivet, kan NETs fange og dræbe ekstracellulære patogener i blod og væv. Desuden deltager NETs i homeostatisk regulering ved at stimulere blodpladeadhæsion og koagulation. Imidlertid har den dysregulerede produktion af NET'er også været forbundet med forskellige sygdomme, herunder sepsis eller autoimmune lidelser, hvilket gør dem til et lovende mål for terapeutisk intervention. Bortset fra elektronmikroskopi er visualisering af NET'er ved hjælp af immunfluorescensbilleddannelse i øjeblikket en af de eneste kendte metoder til at demonstrere NET-interaktioner i væv. Derfor er der anvendt forskellige farvningsmetoder til visualisering af NETs. I litteraturen beskrives forskellige farvningsprotokoller, og vi identificerede fire nøglekomponenter, der viser høj variabilitet mellem protokoller: (1) de anvendte typer antistoffer, (2) brugen af autofluorescensreducerende midler, (3) antigenhentningsmetoder og (4) permeabilisering. Derfor blev in vitro immunfluorescensfarvningsprotokoller systemisk tilpasset og forbedret i dette arbejde for at gøre dem anvendelige til forskellige arter (mus, mennesker) og væv (hud, tarm, lunge, lever, hjerte, rygmarvsskive). Efter fiksering og paraffinindlejring blev 3 μm tykke sektioner monteret på dias. Disse prøver blev farvet med primære antistoffer mod myeloperoxidase (MPO), citrullineret histon H3 (H3cit) og neutrofilelastase (NE) ifølge en modificeret farvningsprotokol. Lysbillederne blev farvet med sekundære antistoffer og undersøgt ved hjælp af et widefield fluorescensmikroskop. Resultaterne blev analyseret i henhold til et evalueringsark, og forskelle blev registreret semikvantitativt.

Her præsenterer vi en optimeret NET-farvningsprotokol, der passer til forskellige væv. Vi brugte et nyt primært antistof til at plette for H3cit og reducerede uspecifik farvning med et autofluorescensreducerende middel. Desuden demonstrerede vi, at NET-farvning kræver en konstant høj temperatur og omhyggelig håndtering af prøver.