Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

Abstract

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) משתחררות על ידי נויטרופילים כתגובה לזיהום חיידקי או נזק טראומטי לרקמות, אך גם ממלאות תפקיד במחלות אוטואימוניות ודלקות סטריליות. הם מבנים דמויי רשת המורכבים מחוטי דנ"א דו-גדיליים, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים. לאחר שחרורם, NETs יכולים ללכוד ולהרוג פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות. יתר על כן, NETs משתתפים בוויסות הומיאוסטטי על ידי גירוי הידבקות טסיות וקרישה. עם זאת, הייצור המווסת של NETs נקשר גם עם מחלות שונות, כולל אלח דם או הפרעות אוטואימוניות, מה שהופך אותם למטרה מבטיחה להתערבות טיפולית. מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של NETs באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא כיום אחת השיטות הידועות היחידות להדגמת אינטראקציות NET ברקמות. לכן, נעשה שימוש בשיטות צביעה שונות כדי להמחיש NETs. בספרות מתוארים פרוטוקולי צביעה שונים, וזיהינו ארבעה מרכיבים עיקריים המראים שונות גבוהה בין פרוטוקולים: (1) סוגי הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, (2) שימוש בחומרים מפחיתי פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית, (3) שיטות שליפת אנטיגן, ו-(4) חלחול. לכן, פרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטית במבחנה הותאמו ושופרו באופן מערכתי בעבודה זו כדי להפוך אותם לישימים עבור מינים שונים (עכבר, אדם) ורקמות (עור, מעי, ריאות, כבד, לב, דיסק בעמוד השדרה). לאחר קיבוע ושיבוץ פרפין, חלקים בעובי 3 מיקרומטר הותקנו על מגלשות. דגימות אלה הוכתמו בנוגדנים ראשוניים עבור myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit) ו neutrophil elastase (NE) על פי פרוטוקול צביעה שונה. השקפים הוכתמו בנוגדנים משניים ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. התוצאות נותחו על פי דף הערכה, וההבדלים נרשמו באופן כמותי למחצה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול צביעת NET מותאם לרקמות שונות. השתמשנו בנוגדן ראשוני חדשני כדי להכתים עבור H3cit והפחתנו כתמים לא ספציפיים עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הוכחנו כי צביעת רשת דורשת טמפרטורה גבוהה קבועה וטיפול זהיר בדגימות.

Introduction

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הודגמו לראשונה על ידי ברינקמן ועמיתיו כמסלול של מוות תאי שונה מאפופטוזיס ונמק בשנת 20041. במסלול זה, נויטרופילים משחררים את הכרומטין המעובה שלהם לתוך החלל החוץ-תאי כדי ליצור מבנים גדולים דמויי רשת המכוסים בחלבונים אנטי-מיקרוביאליים שהיו מאוחסנים בעבר בגרגירים או בציטוזול. חלבונים אנטי-מיקרוביאליים אלה כוללים אלסטאז נויטרופילים (NE), מיאלופרוקסידז (MPO) והיסטון ציטרוליניציה H3 (H3cit), המשמשים בדרך כלל לזיהוי עקיף של NETs2 באימונופלואורסנציה. שיטה זו לא רק מזהה את הנוכחות הכמותית של חלבונים אלה; ואכן, יש לו את היתרון של זיהוי ספציפי מבנים דמויי NET. ב-NETs, החלבונים שהוזכרו מתמקמים יחד....

Protocol

מחקר זה כלל רקמות עכבר שמקורן בניסויים שאושרו על ידי המנהל הממלכתי של המבורג לחקר בעלי חיים, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, המבורג, גרמניה (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). הרקמות ששימשו היו ריאות עכברים ומעי גס ממודל ספיגה ועור שרוף. השתמשנו בעכברים זכרים ונקבות בני 8 שבועות. הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU בנושא.......

Representative Results

לפני שהתחלנו באופטימיזציה של הפרוטוקולים שלנו, זיהינו שלבים מרכזיים לצביעה מוצלחת על ידי חיפוש PubMed עבור מחקרים שהשתמשו ברקמת FFPE עבור צביעה חיסונית של NETs והשווינו את הפרוטוקולים שלהם. הבדלי הפרוטוקול המבטיחים ביותר זוהו כשלבי המפתח למיטוב הפרוטוקול, בעוד שצעדים שרובם תאמו זה את זה לא שונ?.......

Discussion

בעבודה זו שאפנו להתאים ולייעל את הפרוטוקולים הקיימים להדמיית NET לסוגי רקמות נוספים, החל מתהליך הצביעה בפועל. הצעד הקריטי הראשון לשיטה זו הוא בחירת הנוגדנים המתאימים ביותר. עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר לא הראה כתמים אמינים בהשוואה ל- NE ממארח ארנב. יתר על כן, Thålin et al.......

Acknowledgements

מחקר זה נוסד על ידי חברת המחקר הגרמנית (BO5534). אנו מודים לאנטוניה קיוויט, מוריץ לנץ, יוהנה האגנס, ד"ר אניקה הואר וד"ר אינגו קוניגס על שסיפקו לנו דגימות. בנוסף, המחברים מודים לצוות של מתקן הדמיה מיקרוסקופיה UKE (מתקן הליבה, בית הספר לרפואה של UKE) על התמיכה במיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
      Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µgabcamAb 68672 1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µgabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µgabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µgabcamAb 908101:50
Axiovision Microscopy Software Zeiss4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50mlGeneTex GTX30972
CoverslipsMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antibody dilution 500 mLDCS diagnosticsDCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Donkey anti rabbit AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Donkey anti rabbit Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Mounting MediumInvitrogen00-4958-02
Glass slide rackRothH552.1
Human/Mouse MPO AntibodyR&D SystemsAF 3667 1:20
Hydrophobic PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Microscopy cameraZeissAxioCamHR3
MicrowaveBoschHMT84M421
Mouse IgG1 negative controlDakoX0931 Aglient1:50 and 1:5
Normal Goat IgG ControlR&D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP staining jarRoth2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µgabcamAb 2194061:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus slidesR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Water bathMemmert830476
Water bath rice cookerreishungerRCP-30
Wet chamberWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotect....

Explore More Articles

NETsDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved