Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.