Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Neutrofila extracellulära fällor (NET) frigörs av neutrofiler som svar på bakterieinfektion eller traumatisk vävnadsskada, men spelar också en roll vid autoimmuna sjukdomar och steril inflammation. De är nätliknande strukturer som består av dubbelsträngade DNA-filament, histoner och antimikrobiella proteiner. När NET väl har släppts ut kan de fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad. Dessutom deltar NET i homeostatisk reglering genom att stimulera trombocytadhesion och koagulation. Men den dysreglerade produktionen av NET har också förknippats med olika sjukdomar, inklusive sepsis eller autoimmuna sjukdomar, vilket gör dem till ett lovande mål för terapeutisk intervention. Förutom elektronmikroskopi är visualisering av NET med hjälp av immunofluorescensavbildning för närvarande en av de enda kända metoderna för att påvisa NET-interaktioner i vävnad. Därför har olika färgningsmetoder för att visualisera NET använts. I litteraturen beskrivs olika färgningsprotokoll, och vi identifierade fyra nyckelkomponenter som visar hög variabilitet mellan protokollen: (1) de typer av antikroppar som används, (2) användningen av autofluorescensreducerande medel, (3) antigenhämtningsmetoder och (4) permeabilisering. Därför har in vitro immunofluorescensfärgningsprotokoll systematiskt anpassats och förbättrats i detta arbete för att göra dem tillämpliga för olika arter (mus, människa) och vävnader (hud, tarm, lunga, lever, hjärta, ryggskiva). Efter fixering och paraffininbäddning monterades 3 μm tjocka sektioner på objektglas. Dessa prover färgades med primära antikroppar för myeloperoxidas (MPO), citrullinerad histon H3 (H3cit) och neutrofil elastas (NE) enligt ett modifierat färgningsprotokoll. Objektglasen färgades med sekundära antikroppar och undersöktes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Resultaten analyserades enligt ett utvärderingsformulär och skillnader registrerades semikvantitativt.

Här presenterar vi ett optimerat NET-färgningsprotokoll som lämpar sig för olika vävnader. Vi använde en ny primär antikropp för att färga för H3cit och minskade ospecifik färgning med ett autofluorescensreducerande medel. Vidare visade vi att NET-färgning kräver en konstant hög temperatur och noggrann hantering av prover.