İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.

Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.