ברצוננו להודות למעבדות בקהילת C. elegans שפיתחו ושיתפו את הכלים ושעבודתם מצוטטת בכתב יד זה. חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מענק של פרויקט המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) ל- A.L.S. (PJT-175245). C.L. נתמכת על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של מועצת מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (PGS-D).

תורשה אפיגנטית ו- ChIP ב - Caenorhabditis elegans

<ol>
	<li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li><li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans.">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li><li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality.">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li><li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+silencing+by+RNAi.">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882 (2006).</li><li>Lee, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts.">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li><li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li><li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans.">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).</li><li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline.">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li><li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus.">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li><li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways.">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li><li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes.">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448 (2019).</li><li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance.">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li><li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses.">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797 (2021).</li><li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans.">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li><li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans.">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li><li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein.">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li><li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+coordinate+poly(UG)+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing.">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+GeneticsWormBook:+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology.">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record.">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans.">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li><li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint.">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li><li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10, 6 (2017).</li><li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing.">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li><li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance.">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi.">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li><li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans.">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li><li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans.">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li><li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans.">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li></ol>

כל המחברים מאשרים כי אין להם התנגשויות לחשוף.

בפרוטוקול זה, dsRNA מוצג על ידי האכלה, אשר הפך לשיטה סטנדרטית ב- C. elegans18. עבור מבחני תורשה RNAi, גישת ההזנה מספקת שיטה קלה להשגת אוכלוסיית P0 גדולה 2,11,12,22,23,24,25. עם זאת, העיתוי ומשך החשיפה ל-RNAi משפיע על יעילות השתקת הטרנסגנים26, וריכוז חיידקי ה-RNAi משפיע על ההתמדה של השתקת RNAi תורשתית1. לכן, חיידקי RNAi מתוקננים וצמיחת תולעים חשובים להשגת רמה עקבית של השתקת GFP ומשך הירושה. כאן, עוברים מצופים על לוחות RNAi כך שחיות P0 נחשפות לחיידקי RNAi מהבקיעה. גישות חלופיות ציפו חיות שלב מסונכרנות L1 24,27 אוL4 25 על לוחות RNAi-NGM. בנוסף, מכיוון שרעב ולחצים אחרים משפיעים על תחזוקת תורשה RNAi13, יש לפקח על הצלחות כדי למנוע צפיפות ותשישות של אספקת המזון. כחלופה להתחלת RNAi על ידי הזנה, חלק ממחקרי התורשה החלוציים של C. elegans RNAi גרמו ל-RNAi באמצעות הזרקת גונאד, המספקת שליטה גדולה יותר בריכוז dsRNA 1,28.
בפרוטוקול זה, כל דור עובר כאוכלוסייה עם טיפול בהיפוכלוריט אלקליין, כפי שתואר קודם לכן 16,22,23,24. טיפול בהיפוכלוריט מבטיח שדור ה-F1 לא יזוהם בחיידקי RNAi מהסביבה ההורית22 ומונע צוואר בקבוק פוטנציאלי בלתי רצוי באוכלוסייה. עם זאת, מעבר בתפזורת עשוי להיות גם מגבלה, שכן לבעלי חיים בודדים עשויים להיות דפוסי ירושה שונים 1,29. שיטה חלופית להקים כל דור היא לבחור בעלי חיים בודדים 1,2,9,11,25. גישה זו מאפשרת מעקב אחר פנוטיפים בתוך שושלות ושילוב של צלבים גנטיים. ניתוח שושלת עשוי להיות יתרון גם עבור פנוטיפים של חדירה נמוכה12.
ביטוי חלבון פלואורסצנטי הוא קריאה עוצמתית ונוחה של השתקה הנגרמת על ידי RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. כמתואר בפרוטוקול זה, ניתן להבקיע ביטוי GFP באופן ידני כ- ON או OFF 11,12,15,16,25. ניתן לשפר עוד יותר את הניקוד הידני על ידי הקצאת רמות עצימות איכותיות 3,4,14. לחלופין, ניקוד עוצמה אוטומטי של תמונות מיקרוסקופיה 11,12,14,25,27 או מדידת פלואורסצנטיות של ציטומטריית זרימה של בעלי חיים2 יכולים לספק קריאה כמותית ובעלת תפוקה גבוהה. עם זאת, מכיוון שהביטוי של הכתב מוגבל לקו הנבט, אזהרה של גישות אוטומטיות היא שהן חייבות גם להבדיל בין בעלי חיים עם ביטוי GFP מושתק לעומת בעלי חיים ללא קו נבט, במיוחד אם המחקר משלב מוטנטים עם התפתחות לא תקינה של קו הנבט. כחלופה לפלואורסנציה של GFP, ניתן להשתמש בשעתוק לאחור (RT)-qPCR כדי לכמת את רמות המטרה של RNAi pre-mRNA ו-mRNA 2,16,23,24. גישה זו מספקת קריאה ישירה יותר של השתקה, המכוונת לרנ"א, והיא שימושית במיוחד עבור מטרות RNAi אחרות שבהן השתקה אינה מייצרת פנוטיפ נראה לעין. מגבלה בשימוש בכתבי GFP מלאכותיים היא שרצפים אקסוגניים ואנדוגניים מווסתים באופן דיפרנציאלי ב-RNAi11 בין-דורי. לפיכך, יש לשקול מחקרים עם מטרות אנדוגניות, כגון האלל הקטלני העוברי הרגיש לטמפרטורה oma-1(zu405)1,11,16,25, כגישה משלימה למדווחי טרנסגנים פלואורסצנטיים.
ניתוח ChIP בהקשר של מבחני תורשה RNAi דורש השוואה בין טיפולים ושכפולים. ראשית, כדי להסביר את ההבדלים בחומר המוצא בין הדגימות, אות ChIP מנורמל לאות קלט באותו מוקד כמו 'אחוז הקלט'. עיבוד של Histone H3 ChIP במקביל יעזור לקבוע אם שינויים כלשהם בשינוי ההיסטון תואמים לשינויים בצפיפות הנוקלאוזומים. בנוסף, מכיוון ש- ChIP הוא תהליך רב-שלבי, היעילות עשויה להשתנות בין דגימות. הבחירה של מוקדי בקרה חיוביים ושליליים מתאימים שימושית כדי להעריך ולהשוות את יחס האות לרעש בין דגימות וניסויים. בנוסף, כדי להקל על השוואות בין דגימות, ערכי מחזור הסף של ChIP DNA qPCR ביעד RNAi מנורמלים לעתים קרובות למוקד בקרה 3,11,15,23,30,31. כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול ב-RNAi, משווים גם את היחס בין אות ה-ChIP בטיפול ב-RNAi לעומת תנאי RNAi של בקרה או ללא תנאי RNAi. מגבלה של הגישה הנוכחית היא כי ChIP מבוצע עם בעלי חיים שלמים, בעוד התגובה לטיפול RNAi עשוי להיות ייחודי לקו הנבט. גישה להתגבר על אזהרה זו היא לבצע ChIP באמצעות גרעיני נבט מבודדים. שיקולים טכניים נוספים לאופטימיזציה של ChIP נדונו בהרחבה גם במקומות אחרים32,33.
בסך הכל, פרוטוקול תורשה ו-ChIP זה של RNAi מספק בסיס מפורט וקל להסתגלות שניתן לשלב עם טכניקות אחרות כדי להמשיך לחקור רגולציה אפיגנטית בין-דורית. לדוגמה, ספריות ריצוף בתפוקה גבוהה יכולות להיבנות מהדנ"א ChIP (ChIP-seq) לקבלת תצוגה מפורטת יותר של נוף הכרומטין הן קרוב למטרה RNAi והן בקנה מידה גנומי רחב.

תורשה אפיגנטית מאפשרת העברת מידע על בקרת גנים בין דורות ולכן יכולה לאפשר לסביבה או לחוויות של ההורים להשפיע על צאצאיהם. ב- C. elegans, השתקת גנים של קו הנבט המופעלת על ידי RNA דו-גדילי אקסוגני (dsRNA) יכולה לעבור בתורשה במשך דורות רבים בצאצאים שלא נחשפו לטריגר המקורי 1,2,3,4. תהליך זה, המכונה RNA interference (RNAi) inheritance, הוא אחת ממספר תופעות השתקה אפיגנטיות קשורות ב- C. elegans, כולל השתקה רב-דורית ביוזמת piRNA 2,5, paramutation/RNAe (השתקה אפיגנטית הנגרמת על ידי RNA) 6,7,8, והשתקה ביוזמת מערך multicopy9, שיש להם דרישות חופפות אך נפרדות למכונות ויסות RNA וכרומטין קטנות . ב-C. elegans exogenous RNAi, dsRNA מעובד ל-RNA מפריע קטן (siRNAs) הפועל בקומפלקס עם חלבוני ארגונאוט ראשוניים כדי לזהות את mRNA המטרה שלהם. מיקוד זה מוביל להגברה של siRNA משני המשויך לארגונאוטים משניים כדי להשתיק mRNA מטרה דרך מסלולי השתקה ציטופלזמיים וגרעיניים כאחד. עבור מטרות RNAi המבוטאות בתאי נבט, המשנה הגרעינית Argonaute HRDE-1 וגורמי RNAi גרעיניים נוספים מכוונים לתעתיקים מתהווים, וכתוצאה מכך דיכוי שעתוק וגיוס של מתילטרנספראזות היסטון להפקדת סימני כרומטין מדכאים, כולל H3K9me310. Histone H3K9me3 מקדם הקמת השתקה תורשתית של טרנסגנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתבטא בנבט על ידי ירושת RNAi11,12.
מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטרנסגן המבטא חלבון היתוך GFP-היסטון בקו הנבט ככתב לתורשה RNAi ולהעריך שינויים בשינויים בהיסטון במוקד הטרנסגן של הכתב באמצעות משקעים חיסוניים של כרומטין ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (ChIP-qPCR). פרוטוקול זה מתאר גישת הזנת RNAi סטנדרטית מבוססת צלחת ליזום השתקת כתבים. הוא גם מספק ציר זמן מפורט להעברת בעלי חיים בין דורות על ידי בידוד עוברי רחם ממבוגרים גרבידיים על ידי טיפול בהיפוכלוריט אלקליין ('הלבנה'). כמו כן מתוארות שיטות ונתונים מייצגים לניטור תדירות השתקת GFP בתת-קבוצה של האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועבור היסטון H3K9me3 ChIP-qPCR. מבחני תורשה מבוססי כתב RNAi מספקים מערכת יעילה ביותר לנתח באופן פונקציונלי את תפקידם של גורמים גנטיים וסביבתיים בוויסות אפיגנטי 13,14, ובדיקות גנטיות באמצעות כתבים כאלה זיהו הן גנים הדרושים עבור 2,3,15 והן גנים המווסתים באופן שלילי 16,17 את משך התורשה האפיגנטית הבין-דורית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMP201</td>
			<td>Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td>Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (6% Sodium hypochlorite)</td>
			<td>Lavo</td>
			<td>02358107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain with GFP RNAi Reporter</td>
			<td>NA</td>
			<td>SX1263</td>
			<td>Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CAR544</td>
			<td>Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain HT115(DE3)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain OP50-1</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td>Make a 1.25 M solution and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>H1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Printed Slides, 10 wells</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100488-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>NON999</td>
			<td>Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001</td>
			<td>Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates supplemented with 100 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard lab recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole (Tetramisole hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756</td>
			<td>Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl (8 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator (1.5 mL tubes)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator (0.2 mL tubes)</td>
			<td>Permagen</td>
			<td>MSR812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Technologist Choice</td>
			<td>LAB-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5 M)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td>For ChIP buffers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make a 10 M solution and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM Plates</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &#956;g/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 &#181;g/mL streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG (1 mg/mL)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (35 mm x 10 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1135.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid - Control RNAi&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>L4440 (Plasmid #1654)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid - GFP-targetting RNAi&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>L4417 (Plasmid #1649)</td>
			<td>Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [clec-18]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [gfp exon 1]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [gfp exon 4]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [hrp-2]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-37084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi-NGM plates</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &#181;g/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 &#181;g/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5777</td>
			<td>Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74255</td>
			<td>Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication Tube</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>214-3721-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication Tube Cap</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>300-2911-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q800R3-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>STP101</td>
			<td>Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer (1X)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter clicker</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TET701</td>
			<td>Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transgenerational epigenetic inheritance in c. elegans using a fluorescent reporter and chromatin immunoprecipitation (chip)

תורשה אפיגנטית בין-דורית (TEI) מאפשרת העברת מידע דרך קו הנבט מבלי לשנות את רצף הגנום, באמצעות גורמים כגון RNA לא מקודד ושינויים בכרומטין. תופעת תורשה של הפרעות RNA (RNAi) בנמטודה Caenorhabditis elegans היא מודל יעיל לחקר TEI המנצל את מחזור החיים הקצר של אורגניזם מודל זה, התפשטות עצמית ושקיפות. בתורשה של RNAi, חשיפה של בעלי חיים ל-RNAi מובילה להשתקת גנים ולשינויים בחתימות הכרומטין במיקום המטרה שנמשכים מספר דורות בהיעדר הטריגר הראשוני. פרוטוקול זה מתאר את ניתוח תורשה RNAi ב- C. elegans באמצעות כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק גרעיני (GFP) המבוטא על ידי נבט. השתקת הכתבים מתבצעת על ידי האכלת בעלי החיים בחיידקים המבטאים RNA דו-גדילי המכוון ל-GFP. בכל דור עוברים בעלי חיים כדי לשמור על התפתחות מסונכרנת, והשתקת גנים נקבעת במיקרוסקופיה. בדורות נבחרים, אוכלוסיות נאספות ומעובדות עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית של כרומטין (ChIP) (qPCR) כדי למדוד את העשרת שינוי ההיסטון במוקד כתב GFP. פרוטוקול זה לחקר תורשה RNAi ניתן לשינוי בקלות ומשולב עם ניתוחים אחרים כדי להמשיך לחקור גורמי TEI במסלולי RNA וכרומטין קטנים.

Epigenetic inheritance allows the transmission of gene regulatory information across generations and can therefore allow the environment or experiences of parents to affect their progeny. In C. elegans, germline gene silencing initiated by exogenous double-stranded RNA (dsRNA) can be inherited for multiple generations in progeny not exposed to the original trigger1,2,3,4. This process, termed RNA interference (RNAi) inheritance, is one of several related epigenetic silencing phenomena in C. elegans, including piRNA-initiated multigenerational silencing2,5, paramutation/RNAe (RNA-induced epigenetic silencing)6,7,8, and multicopy array-initiated silencing9, which have overlapping but distinct requirements for small RNA and chromatin regulation machinery. In C. elegans exogenous RNAi, dsRNA is processed into small interfering RNAs (siRNAs) that act in a complex with primary Argonaute proteins to recognize their target mRNA. This targeting leads to the amplification of secondary siRNAs that associate with secondary Argonautes to silence target mRNA through both cytoplasmic and nuclear silencing pathways. For germline-expressed RNAi targets, the nuclear secondary Argonaute HRDE-1 and additional nuclear RNAi factors target nascent transcripts, resulting in transcriptional repression and recruitment of histone methyltransferases to deposit repressive chromatin marks, including H3K9me310. Histone H3K9me3 promotes the establishment of heritable silencing of germline-expressed green fluorescent protein (GFP) transgenes by RNAi inheritance11,12.
The goal of this protocol is to use a transgene expressing a GFP-histone fusion protein in the germline as a reporter for RNAi inheritance and to assay changes in histone modifications at the reporter transgene locus using chromatin immunoprecipitation and quantitative polymerase chain reaction (ChIP-qPCR). This protocol describes a standardized plate-based RNAi feeding approach to initiate reporter silencing. It also provides a detailed timeline for passaging animals between generations by isolating in utero embryos from gravid adults by alkaline hypochlorite treatment (&#39;bleaching&#39;). Methods and representative data for monitoring the frequency of GFP silencing in a subset of the population by fluorescence microscopy and for histone H3K9me3 ChIP-qPCR are also described. Reporter-based RNAi inheritance assays provide a highly tractable system to functionally dissect the roles of genetic and environmental factors in epigenetic regulation13,14, and genetic screens using such reporters have identified both genes that are required for2,3,15 and genes that negatively regulate16,17 the duration of transgenerational epigenetic inheritance.

מחבר זרקור: RNAi Inheritance ו- ChIP ב- C. elegans 

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Research in our lab examines how chromatin-associated proteins, histone modifications, and small RNA pathway factors work together in the context of development and transgenerational epigenetic inheritance. The RNA inheritance assay, using a GFP reporter, has become a very powerful tool. This protocol describes how to standardize the preparation, scoring, and passaging of worms, and the preparation of ChIP samples, which can help to generate reproducible results.One of the experimental challenges when studying germline-expressed transgenes is isolating the effects in the animal's germline. We're currently using whole animals for ChIP, but in the future we would like to develop assays to examine chromatin, specifically in the germline. Our laboratory is interested in histone methylation and proteins that recognize these marks.Going forward, we would like to investigate the interplay between these chromatin readers and small RNA pathways in the context of RNAi inheritance at transgenes and the regulation of endogenous sequences.

חיות שנשאו את כתב GFP-histone H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 (איור 2A) נחשפו ל-GFP RNAi או לרנ"א בקרה באמצעות האכלה, ועברו כמתואר בפרוטוקול ובאיור 1. אות GFP גרעיני בקו הנבט הובחן ידנית באמצעות מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי עבור דגימה של האוכלוסייה בכל דור. השתקת הטרנסגן חודרת במלואה בחיות P0 ו-F1 שטופלו ב-GFP RNAi (איור 2B). בדור ה-F2, שיעור האוכלוסייה המציגה ירושה של השתקת GFP היה כ-50%. עד דור F5, רוב האוכלוסייה לא הראתה ירושה של השתקה, ודור F10, לא נמצאה ירושה, כפי שכל בעלי החיים ביטאו GFP.
כדי לקבוע את השינוי בהעשרת H3K9me3 של היסטון המתאים להשתקה הנגרמת על ידי RNAi, ChIP-qPCR בוצע על בעלי חיים מדור F1 לאחר טיפול RNAi GFP או RNAi בקרה. כצפוי, האוכלוסייה שטופלה ב-GFP RNAi הציגה רמות גבוהות יותר של היסטון H3K9me3 ביעד ה-GFP ובאזור של 1.3 קילו-בתים במורד הזרם בהשוואה לחיות ביקורת שטופלו ב-RNAi (איור 2C). הספציפיות של ההיסטון H3K9me3 ChIP נתמכת על ידי העשרה במוקד בקרה חיובי (clec-18) הידוע כמועשר בסימן זה, אך לא במוקד בקרה שלילי קרוב (hrp-2). העשרת Histone H3 והעשרת כמעט רקע במשקעים החיסוניים של בקרת IgG זוהו גם הם בכל מוקדי qPCR, כצפוי. כאשר העשרת ChIP אצל המדווח מנורמלת למוקד הבקרה החיובי clec-18 , מוצגת העשרה גבוהה יותר של היסטון H3K9me3 על RNAi GFP, בעוד שהעשרת H3 של היסטון דומה בין הביקורת לבין טיפולי RNAi של GFP (איור 2D). מכיוון ש-GFP RNAi אינו צפוי להשפיע על היסטון H3K9me3 או על תפוסה כוללת של היסטון H3 בלוקוס clec-18 , נורמליזציה זו ממתנת את השונות הטכנית, כגון הבדלים ביעילות ChIP בין RNAi GFP לבין דגימות RNAi בקרה. שינוי הקיפול של רמות ההיסטון H3K9me3 וההיסטון H3 בין טיפולי RNAi מראה העשרה ספציפית של היסטון H3K9me3 לכתב GFP, ללא תלות בתפוסת ההיסטון, בהשתקה הנגרמת על ידי GFP RNAi (איור 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> איור 2: השתקה הנגרמת על ידי GFP RNAi מתאימה להעשרה מוגברת של H3K9me3 ביעד ה-RNAi. (A) דיאגרמה של כתב ה-GFP RNAi mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] עם אזורי אמפליקון qPCR מסומנים. (B) ביטוי GFP הבקיע לאורך דורות לאחר טיפולי RNAi ב 21 ° C. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן משני משכפלים ביולוגיים. (C) בקרת ChIP-qPCR של H3K9me3, היסטון H3 ו-IgG בצעירים בפורמולה 1 משני שכפולים ביולוגיים. CLEC-18 ו-HRP-2 הם מוקדי הבקרה החיוביים והשליליים להעשרת H3K9me3, בהתאמה. (D) H3K9me3 והעשרת היסטון H3 בכתב RNAi GFP מנורמל למוקד הבקרה החיובי clec-18. (E) שינוי בהעשרת H3K9me3 וההיסטון H3 בין GFP RNAi ובעלי חיים שטופלו ב-RNAi בקרה, עם נורמליזציה ל-clec-18. קו מקווקו מייצג שינוי קיפול של 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

המחקר במעבדה שלנו בוחן כיצד חלבונים הקשורים לכרומטין, שינויים בהיסטון וגורמי מסלול RNA קטנים פועלים יחד בהקשר של התפתחות ותורשה אפיגנטית בין-דורית. בדיקת ירושת RNA, באמצעות כתב GFP, הפכה לכלי רב עוצמה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לתקנן את ההכנה, הניקוד והמסירה של תולעים, ואת הכנת דגימות ChIP, שיכולות לסייע ביצירת תוצאות הניתנות לשחזור.אחד האתגרים הניסיוניים בחקר טרנסגנים המבוטאים בנבט הוא בידוד ההשפעות בקו הנבט של החיה. כיום אנו משתמשים בבעלי חיים שלמים עבור ChIP, אך בעתיד נרצה לפתח בדיקות לבדיקת כרומטין, במיוחד בקו הנבט. המעבדה שלנו מתעניינת במתילציה של היסטון ובחלבונים שמזהים את הסימנים האלה.בהמשך, ברצוננו לחקור את יחסי הגומלין בין קוראי הכרומטין הללו לבין מסלולי רנ"א קטנים בהקשר של תורשה של RNAi בטרנסגנים והרגולציה של רצפים אנדוגניים.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Abstract