A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.
מודלים של גידולים הם קריטיים לבדיקה פרה-קלינית של גידולי מוח במונחים של בחינת טיפולים חדשים ויעילים יותר. עם עניין משמעותי באימונותרפיה, חיוני עוד יותר שיהיה מודל עקבי, רלוונטי קלינית וכשיר חיסון של עכברים כדי לבחון את אוכלוסיות הגידול ותאי החיסון במוח ואת תגובתם לטיפול. בעוד שרוב המודלים הפרה-קליניים משתמשים בהשתלה אורתוטופית של קווי תאי גידול מבוססים, מערכת המידול המוצגת כאן מאפשרת ייצוג "מותאם אישית" של מוטציות גידוליות ספציפיות למטופל בהתפתחות הדרגתית אך יעילה ממבני DNA המוחדרים לתאים מבשרי עצבים מתחלקים (NPCs) in vivo. מבני דנ"א כוללים את ניתוח הפסיפס בשיטת MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), המאפשרת מוטגנזה סומטית של מוטציות מניעות בעותק יחיד. באמצעות גורי עכברים שזה עתה נולדו בין הלידה לגיל 3 ימים, NPCs ממוקדים על ידי ניצול התאים המתחלקים האלה המצפים את החדרים הצדיים. מיקרו-הזרקה של פלסמידים של DNA (למשל, MADR-derived, טרנספוזונים, sgRNA מכוון קריספר) לתוך החדרים מלווה אלקטרופורציה באמצעות משוטים המקיפים את האזור הרוסטרלי של הראש. לאחר גירוי חשמלי, הדנ"א נקלט לתוך התאים המתחלקים, עם פוטנציאל להשתלב בגנום. השימוש בשיטה זו הוכח בהצלחה בפיתוח גידולי מוח הן בילדים והן במבוגרים, כולל גידול המוח הממאיר הנפוץ ביותר, גליובלסטומה. מאמר זה דן ומדגים את השלבים השונים של פיתוח מודל גידול במוח באמצעות טכניקה זו, כולל הליך של הרדמת גורי עכברים צעירים, למיקרו-הזרקה של תערובת הפלסמיד, ולאחר מכן אלקטרופורציה. באמצעות מודל עכבר אוטוכתוני וחיסוני זה, לחוקרים תהיה היכולת להרחיב גישות מודלים פרה-קליניים, במאמצים לשפר ולבחון טיפול יעיל בסרטן.
מודלים של גידולי מוח הם חיוניים להבנת המנגנונים של היווצרות גידולי מוח וטיפול בהם. המודלים הנוכחיים כוללים בדרך כלל השתלות תת-עוריות או אורתוטופיות המיוצרות במהירות של קווי תאים סרטניים נפוצים, בהתבסס על מספר מוגבל של מוטציות מניעות או מודלים של xenograft שמקורם בחולה, תוך שימוש בעכברים מדוכאי חיסון המעכבים מחקרי אימונותרפיה תקינים 1,2,3,4. בנוסף, תוצאות פרה-קליניות אלה יכולות להוביל לתוצאות חיוביות שגויות, בכך שמודלים כאלה יכולים להציג השפעות דרמטיות, לעתים קרובות מרפאות, בתגובה לטיפול, אך זה לא מתורגם למרפאה 2,5,6,7....
כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי סידרס סיני (IACUC). עכברי mTmG הומוזיגוטיים גודלו עם עכברי C57BL/6J כדי להשיג המלטות של עכברי mTmG מעורבים, הטרוזיגוטיים לשימוש בפרוטוקול הבא. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים
הפרוטוקול המתואר לעיל שימש לפיתוח מוצלח של מודלים של עכברי גידול מוח בילדים ובמבוגרים, כאשר הראשון פורסם בפירוט רב בכתב העת Kim et al.8. עם טכניקה נכונה ותכנון קפדני של תכנון פלסמיד, ההצלחה לפיתוח EP של גידולים היא בדרך כלל 100%. היסטולוגיה היא הדרך המהירה והקלה ביותר לבדוק החדרה מוצל.......
העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד מאפשרת שימוש in vivo בביולוגיה מולקולרית, בדומה לזו המשמשת במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, אך עם המהירות, הלוקליזציה והיעילות של התמרה ויראלית 8,13,14. עם זאת, עם האחרון מגיעים חששות בטיחות, כמו גם ת?.......
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים לג'י בום קים על הצביעה האימונופלואורסצנטית והתמונות. אנו מודים גם לאמילי הטנאקה, נעמי קובריץ ופול לינש על העצות המועילות לגבי הפרוטוקול.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved