Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.

Abstract

מודלים של גידולים הם קריטיים לבדיקה פרה-קלינית של גידולי מוח במונחים של בחינת טיפולים חדשים ויעילים יותר. עם עניין משמעותי באימונותרפיה, חיוני עוד יותר שיהיה מודל עקבי, רלוונטי קלינית וכשיר חיסון של עכברים כדי לבחון את אוכלוסיות הגידול ותאי החיסון במוח ואת תגובתם לטיפול. בעוד שרוב המודלים הפרה-קליניים משתמשים בהשתלה אורתוטופית של קווי תאי גידול מבוססים, מערכת המידול המוצגת כאן מאפשרת ייצוג "מותאם אישית" של מוטציות גידוליות ספציפיות למטופל בהתפתחות הדרגתית אך יעילה ממבני DNA המוחדרים לתאים מבשרי עצבים מתחלקים (NPCs) in vivo. מבני דנ"א כוללים את ניתוח הפסיפס בשיטת MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), המאפשרת מוטגנזה סומטית של מוטציות מניעות בעותק יחיד. באמצעות גורי עכברים שזה עתה נולדו בין הלידה לגיל 3 ימים, NPCs ממוקדים על ידי ניצול התאים המתחלקים האלה המצפים את החדרים הצדיים. מיקרו-הזרקה של פלסמידים של DNA (למשל, MADR-derived, טרנספוזונים, sgRNA מכוון קריספר) לתוך החדרים מלווה אלקטרופורציה באמצעות משוטים המקיפים את האזור הרוסטרלי של הראש. לאחר גירוי חשמלי, הדנ"א נקלט לתוך התאים המתחלקים, עם פוטנציאל להשתלב בגנום. השימוש בשיטה זו הוכח בהצלחה בפיתוח גידולי מוח הן בילדים והן במבוגרים, כולל גידול המוח הממאיר הנפוץ ביותר, גליובלסטומה. מאמר זה דן ומדגים את השלבים השונים של פיתוח מודל גידול במוח באמצעות טכניקה זו, כולל הליך של הרדמת גורי עכברים צעירים, למיקרו-הזרקה של תערובת הפלסמיד, ולאחר מכן אלקטרופורציה. באמצעות מודל עכבר אוטוכתוני וחיסוני זה, לחוקרים תהיה היכולת להרחיב גישות מודלים פרה-קליניים, במאמצים לשפר ולבחון טיפול יעיל בסרטן.

Introduction

מודלים של גידולי מוח הם חיוניים להבנת המנגנונים של היווצרות גידולי מוח וטיפול בהם. המודלים הנוכחיים כוללים בדרך כלל השתלות תת-עוריות או אורתוטופיות המיוצרות במהירות של קווי תאים סרטניים נפוצים, בהתבסס על מספר מוגבל של מוטציות מניעות או מודלים של xenograft שמקורם בחולה, תוך שימוש בעכברים מדוכאי חיסון המעכבים מחקרי אימונותרפיה תקינים 1,2,3,4. בנוסף, תוצאות פרה-קליניות אלה יכולות להוביל לתוצאות חיוביות שגויות, בכך שמודלים כאלה יכולים להציג השפעות דרמטיות, לעתים קרובות מרפאות, בתגובה לטיפול, אך זה לא מתורגם למרפאה 2,5,6,7....

Protocol

כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי סידרס סיני (IACUC). עכברי mTmG הומוזיגוטיים גודלו עם עכברי C57BL/6J כדי להשיג המלטות של עכברי mTmG מעורבים, הטרוזיגוטיים לשימוש בפרוטוקול הבא. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים

Representative Results

הפרוטוקול המתואר לעיל שימש לפיתוח מוצלח של מודלים של עכברי גידול מוח בילדים ובמבוגרים, כאשר הראשון פורסם בפירוט רב בכתב העת Kim et al.8. עם טכניקה נכונה ותכנון קפדני של תכנון פלסמיד, ההצלחה לפיתוח EP של גידולים היא בדרך כלל 100%. היסטולוגיה היא הדרך המהירה והקלה ביותר לבדוק החדרה מוצל.......

Discussion

העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד מאפשרת שימוש in vivo בביולוגיה מולקולרית, בדומה לזו המשמשת במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, אך עם המהירות, הלוקליזציה והיעילות של התמרה ויראלית 8,13,14. עם זאת, עם האחרון מגיעים חששות בטיחות, כמו גם ת?.......

Acknowledgements

אנו מודים לג'י בום קים על הצביעה האימונופלואורסצנטית והתמונות. אנו מודים גם לאמילי הטנאקה, נעמי קובריץ ופול לינש על העצות המועילות לגבי הפרוטוקול.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-2.5 µL 1-channel pipetteEppendorf3123000012
2 µL pipette tipsFisher Scientific02-707-442
20 µL pipette tipsFisher Scientific02-707-432
2-20 µL 1-channel pipetteEppendorf3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation SolutionsFisher ScientificAM9890
ECM 830 Square Porator ElectroporatorBTX45-0662
Electrode GelParker LabsPLI152CSZ
Fast Green DyeSigma-AldrichF7258-25G
Helping Hands Soldering AidPro'sKit900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight SharpRobozRS-5916
Mouse Strain: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryJAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson Laboratory JAX: 007676
ParafilmGrainger16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm DiameterBTX45-0488
Sharps container, 1-quartUlineS-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm IDWorld Precision Instruments1B100F-4Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. 
Vertical Micropipette PullerSutter InstrumentsP-30Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. 
Vimoba Tablet SolutionQuip LaboratoriesVIMTAB
XenoWorks Digital MicroinjectorSutter InstrumentsBRE
XenoWorks Micropipette HolderSutter InstrumentsBR-MH

References

Explore More Articles

In VivoDNADNANPCsMADRDNASgRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved