이 작업은 NIH의 OD R24 보조금 OD031956 및 NICHD R01 보조금 HD073104의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜에 대한 유용한 토론과 초기 의견을 주신 Darcy Kelly에게 감사드립니다. 또한 도움과 지원을 해주신 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Wil Ratzan과 피드백을 주신 익명의 피어 리뷰어 3명에게도 감사드립니다.

모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.
참고: 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)는 안락사의 일차적인 방법이 안락사에 대해 받아들일 수 있는 것으로 간주되지만12, 심장 박동을 멈추게 하는 것으로 밝혀지지는 않았다13. 자주 사용되는 이중 pithing의 ...

Blood Perfusion in African Clawed Frogs for transcriptomics and proteomics(전사체학 및 단백질체학을 위한 아프리카 발톱 개구리의 혈액 관류)

<ol>
	<li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum.">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog,+Xenopus+laevis+(Daudin):+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li><li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis+Daudin:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li><li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li><li>Miodo&#324;ski, A. J., B&#228;r, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+(Rana+temporaria,+Rana+esculenta).+Scanning+electron-microscopic+(SEM)+study+of+microcorrosion+casts.">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li><li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease.">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis.">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution.">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution.">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).</li><li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals,+2020+edition.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , 37 (2020).</li><li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+(Xenopus+laevis).">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America.">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li><li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vertebrate+heart:+an+evolutionary+perspective.">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li><li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+protocol+for+lizards,+including+a+method+for+brain+removal.">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li></ol>

이 프로토콜은 체강에 접근하기 위한 전통적인 해부 기술을 설명합니다. 조직에 최소한의 손상을 입히고 심장에 접근 할 수 있으며 폐와 위가 보이는 경우 다른 기술도 허용됩니다. 마찬가지로, 나열된 대부분의 해부 도구는 유사한 항목으로 쉽게 대체할 수 있습니다.
이 절차의 효능을 최적화하기 위한 시도가 있었지만 결과는 개인의 경험과 개별 개구리 간의 가변성에 따라...

양서류의 전신 관류는 보존과 고정을 위해 일상적으로 이루어진다 1,2,3,4,5,6. 그러나 이러한 절차는 동물당 채취할 수 있는 신선한 샘플의 수를 제한하는 속도로 발생합니다. 이 연구의 목표는 Xenopus에서 효과적인 혈액 관류 프로토콜을 개발하여 기술의 속도를 우선시하는 것입니다. 이 프로토콜은 X. tropicalis의 경우 동물당 10분 미만, X. laevis 동물당 15분 미만이 소요됩니다. 두 번째 우선 순위는 복제의 용이성과 쉽게 획득할 수 있는 장비의 사용으로, 고품질 샘플을 Xenopus 실험실 간에 널리 공유할 수 있습니다.
Xenopus 개구리는 종에 걸쳐 보존된 기본적인 생물학적 및 병리학적 과정을 연구하기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 이 네발 동물은 다른 수생 모델보다 포유류와 더 밀접한 진화 관계를 가지고 있으며, 폐, 3 개의 방이있는 심장 및 손가락이있는 팔다리를 가지고 있습니다. 국제 사회는 Xenopus 를 효과적으로 사용하여 심층적인 질병 모델링 및 질병 관련 유전자 기능의 분자 분석을 통해 인간 질병에 대한 더 깊은 이해를 얻습니다. 동물 모델로서 Xenopus 의 수많은 장점은 인간 발달 및 질병의 분자 기초를 연구하는 데 매우 귀중한 도구입니다. 이러한 장점에는 큰 난모세포 및 배아 크기, 높은 생식력, 주거 용이성, 신속한 외부 발달 및 게놈 조작 용이성이 포함됩니다. 제노푸스는 확인된 인간 질병 유전자의 ~80%를 공유하는 것으로 추정된다7.
널리 사용되는 포유류 모델과 비교할 때, Xenopus는 모르폴리노 녹다운이 용이하고 CRISPR8을 사용하여 효율적인 형질전환 및 표적 유전자 돌연변이를 사용할 수 있는 빠르고 비용 효율적인 모델입니다. 정량적 질량분석법과 단일세포 전사체학(single-cell transcriptomics)이 제노푸스 배아(Xenopus embryos)9,10에 성공적으로 적용되었지만, 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 최근 세포 지도는 대부분의 조직의 구성이 혈구 유형에 의해 지배된다는 것을 보여준다 11. 빠른 속도로 조직을 피폐화하는 기술을 개발하고 냉각 매체를 사용함으로써 시료의 신선도는 관류에 의해 최소화됩니다. 이는 생리학적으로 교란되지 않은 mRNA 또는 단백질 발현을 프로파일링하는 것이 목표인 응용 분야에서 특히 중요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying glass with LED light and stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting fine-pointed forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection pins</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PIN-#3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 22 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>for X. laevis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 25 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>for X. tropicalis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, porcine intestinal mucosa</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>37-505-410MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B09PTX6M2Z</td>
			<td>size will be dependant on the hosing of the pump used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo-Hegar needle holder</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-966</td>
			<td>mosquito forceps are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic liquid pump dosing pump 5&#8211;100 mL/min</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B07PWY4SM6</td>
			<td>any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-112</td>
			<td>optional; for dulling needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen forceps, serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine short insulin syringes, 31 G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD328438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp &#38; powerful side cutter clippers</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B087P191LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective rapid blood perfusion in xenopus

제노푸스는 100년 넘게 척추동물의 발달과 질병을 이해하는 강력한 모델 유기체였습니다. 여기에서는 모든 조직 내에서 일관되고 과감한 혈액 감소를 목표로 하는 Xenopus의 신속한 혈액 관류 프로토콜이 정의됩니다. 관류는 바늘을 심장의 심실에 직접 삽입하고 혈관계를 통해 헤파린 화 인산염 완충 식염수 (PBS)를 펌핑하여 수행됩니다. 절차는 동물 당 약 10 분 안에 완료 할 수 있습니다. 혈액은 몇 가지 매우 풍부한 단백질과 세포 유형에 의해 지배되며, 이러한 단백질이 대부분의 다른 분자와 관심 세포 유형을 가리기 때문에 수많은 문제를 야기합니다. 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학을 사용한 성인 Xenopus 조직의 재현 가능한 특성화는 장기 샘플링 전에 이 프로토콜을 적용함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 조직 샘플링을 위한 프로토콜은 동반 논문에 정의되어 있습니다. 이 절차는 성별, 연령 및 건강 상태가 다른 Xenopus, 특히 X. laevis 및 X. tropicalis의 관행을 표준화하는 것을 목표로합니다.

The whole body perfusion of amphibians is routinely completed for the purposes of preservation and fixation1,2,3,4,5,6. However, these procedures occur at a rate that limits the number of fresh samples that can be taken per animal. The goal of this work is to develop an effective blood perfusion protocol in Xenopus, prioritizing the speed of the technique. The protocol takes less than 10 min per animal for X. tropicalis and less than 15 min per X. laevis animal. The secondary priorities are the ease of replication and the use of easily acquired equipment so that high-quality samples can be shared widely between Xenopus labs.
Xenopus frogs are used widely in biomedical research to study fundamental biological and pathological processes conserved across species. This tetrapod has a closer evolutionary relationship with mammals than other aquatic models, having lungs, a three-chambered heart, and limbs with digits. The international community effectively uses Xenopus to gain a deeper understanding of human disease through in-depth disease modeling and molecular analysis of disease-related gene function. The numerous advantages of Xenopus as an animal model make them invaluable tools to study the molecular basis of human development and disease; these advantages include: large oocyte and embryo size, high fecundity, ease of housing, rapid external development, and ease of genomic manipulation. Xenopus have been estimated to share ~80% of the identified human disease genes7.
Compared to popular mammalian models, Xenopus is a rapid, cost-effective model, with the ease of morpholino knock-down and availability of efficient transgenics and targeted gene mutations using CRISPR8. Quantitative mass spectrometry and single-cell transcriptomics have been successfully applied to Xenopus embryos9,10,&#160;but a recent cell atlas from Xenopus laevis shows that the composition of most tissues is dominated by blood cell types11. By developing a technique that exsanguinates tissue at a rapid rate and using chilled media, the sample freshness is minimally affected by perfusion. This is particularly important for applications where the goal is to profile physiologically unperturbed mRNA or protein expression.

저자 스포트라이트: Xenopus의 효과적인 빠른 혈액 관류  

Xenopus의 효과적인 급속 관류

This procedure centers around the humane utilization of amphibian models in a manner that maximizes efficiency. Standardization practices can be applied to samples taken and preserved at the originating colony, mitigating biosecurity risks and eliminating animal transport stress. Profusion can be completed quickly, maximizing the time available to sample tissues while they are still fresh.This freshness is especially important for proteomic and transcriptomic profiling. This protocol is detailed and explicit, making it usable for individuals with a wide variety of backgrounds. This facilitates the sharing of high-quality samples between Xenopus labs.Along with this profusion technique, a similarly comprehensive protocol is being worked on for the standardized sampling of all major organs.

성공적인 관류 후, 모든 조직 (색소 Xenopus의 간 제외)은 뚜렷하게 가볍고 혈액으로 덜 포화 될 것입니다. 주요 혈관은 눈에 띄지 않게 되고(그림 10), 조직(간 제외)은 샘플링 후 완충액에서 깨끗하게 헹구어집니다. 프로토콜의 성공적인 실행은 궁극적으로 피혈된 조직 샘플의 데이터 품질에 의해서만 확인될 수 있지만 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개?...

Watch this Scientific Journal Video about Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus at JoVE.com

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

이 절차는 효율성을 극대화하는 방식으로 양서류 모델을 인도적으로 활용하는 데 중점을 둡니다. 표준화 관행은 원래 식민지에서 채취 및 보존된 샘플에 적용되어 생물 보안 위험을 완화하고 동물 수송 스트레스를 제거할 수 있습니다. 풍부함은 빠르게 완료될 수 있어 조직이 아직 신선할 때 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있는 시간을 최대화할 수 있습니다.이러한 신선도는 단백질체학 및 전사체 프로파일링에 특히 중요합니다. 이 프로토콜은 상세하고 명시적이어서 다양한 배경을 가진 개인이 사용할 수 있습니다. 이를 통해 Xenopus 실험실 간에 고품질 샘플을 쉽게 공유할 수 있습니다.이 풍부한 기술과 함께 모든 주요 장기의 표준화된 샘플링을 위해 유사하게 포괄적인 프로토콜이 연구되고 있습니다.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

Abstract