Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.

Abstract

טלומרים הם רצפים חוזרים הנמצאים בקצוות הכרומוזומליים; הקיצור שלהם הוא מאפיין אופייני של תאים סומטיים אנושיים. הקיצור מתרחש עקב בעיה בשכפול הסופי והיעדר אנזים הטלומראז, האחראי על שמירת אורך הטלומרים. באופן מעניין, הטלומרים גם מתקצרים בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים פנימיים שונים, כמו עקה חמצונית ודלקת, שעלולים להיות מושפעים מגורמים חוץ-תאיים כמו מזהמים, חומרים זיהומיים, חומרי מזון או קרינה. לפיכך, אורך הטלומרים משמש סמן ביולוגי מצוין להזדקנות ולפרמטרים בריאותיים פיזיולוגיים שונים. ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG משמשת לכימות אורכי הטלומרים הממוצעים באמצעות בדיקת מקטע הגבלת הטלומרים (TRF) והיא ניתנת לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, זוהי שיטה יקרה, ובגלל זה, זה לא משמש באופן שגרתי עבור מספרים מדגם גדול. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידה אופטימלית וחסכונית של אורך הטלומרים באמצעות כתמים דרומיים או ניתוח TRF וזיהוי מבוסס כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית.

Introduction

טלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים הנמצאים בקצה הכרומוזומים. יש להם חזרות דו-צדדיות של TTAGGG והם שומרים על שלמות הגנום על ידי הגנה על הכרומוזום הן מפני שחיקה והן מפני בעיית השכפול הסופית, מה שאומר שחלק מ-3' overhang אינו ניתן לשכפול על ידי DNA פולימראז 1,2. טלומרים קצרים מובילים להפרעות כרומוזומליות בתאים, שבגללן תאים נעצרים לצמיתות בשלב שנקרא הזדקנות משוכפלת3. טלומרים קצרים גורמים גם לשורה של בעיות אחרות, כגון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 4,5 ותפקוד לקוי של התאים.

חזרות טלומריות של דנ"א אובדות כאשר התא מתחלק....

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול להלן. טבלה 1 מגייסת ריאגנטים מתוצרת מעבדה יחד עם נפחים ממוטבים, וטבלה 2 מציגה ריכוזי עבודה של ריאגנטים זמינים מסחרית.

1. תרבית תאים

  1. לשמור על תאים שאורך הטלומרים ש?.......

Representative Results

הדנ"א הגנומי שחולץ (gDNA), שהופעל על ג'ל אגרוז 1%, הראה שלמות טובה, כפי שמוצג באיור 1B, מה שמצביע על כך שהדגימה יכולה לשמש לעיבוד נוסף במורד הזרם של TRFs. לאחר מכן בוצעה בדיקת TRF על ידי שינוי נפחי הפתרונות הנדרשים בכל שלב (ראה טבלה 1 וטבלה 2). אות TRF נראה בבירור (

Discussion

אנו מתארים הליך מפורט לשיטה לא רדיואקטיבית, מבוססת כימילומינסנציה למדידת אורך הטלומרים באמצעות כתם דרומי. הפרוטוקול נבדק כדי לאפשר שימוש מושכל במספר ריאגנטים ללא פשרות על איכות התוצאות. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפרה-הכלאה וההכלאה עד חמש פעמים. ריכוז האנזימים יכול לנוע בין 10-20 U לכל 1.5-2 ?.......

Acknowledgements

ברצוננו להודות לגב' פראצ'י שאה על שעזרה לנו בתחילה באופטימיזציה של הפרוטוקול. ברצוננו להודות לד"ר מנוג' גארג על אספקת קו תאי סרטן השחלות A2780. EK נתמך על ידי מענק מחקר מהמחלקה לביוטכנולוגיה (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), המחלקה למדע וטכנולוגיה (ECR/2018/002117), ומענק זרעים NMIMS (IO 401405).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)BioradUniversal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)BiotekEPOCH2
Software
TeloToolVersion 1.3
Materials
Acetic AcidMolychem64-19-7
AgaroseMP180720
Amphotericin BGibco, ThermoFisher Scientific, USA15240062
DMEM HyClone, Cytiva, USASH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid Molychem6381-92-6
HI FBSGibco, ThermoFisher Scientific, USA10270106
HClMolychem76-47-01-0
NaClMolychem7647-14-5
NaOHMolychem1310-73-2
Nylon membraneSigma11209299001
PenicillinGibco, ThermoFisher Scientific, USA15240062
Sodium dodecyl sulfateAffymetrix151-21-3
StreptomycinGibco, ThermoFisher Scientific, USA15240062
TrisBIORAD77-86-1
Tris HClSigma Aldrich1185-53-1
Whatman paperGE healthcare lifesciences1001-917
Reagents
1 kb ladderNEBN3232S
20x SSCInvitrogen15557-036
Anti DIG APTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Blocking solution 10xTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Cutsmart BufferNEBB6004
Detection buffer 10xTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Dig easy hybTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Digestion BufferTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Hinf 1Telo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)NEBR0155T
Loading DyeBIOLABSN3231S
Maleic acid buffer 10xTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Molecular markerTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
ProbeTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Rsa 1Telo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)NEBR0167L
SubstrateTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001
Wash bufferTelo TAGGG Telomere Length Assay kit12209136001

References

  1. Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
  2. Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
  3. Alls....

Explore More Articles

JoVE194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved