Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Summary

Здесь мы подробно описываем протокол количественного определения длины теломер с использованием нерадиоактивного хемилюминесцентного детектирования с акцентом на оптимизацию различных параметров производительности набора для анализа длины теломер TAGGG, таких как буферные количества и концентрации зонда.

Abstract

Теломеры представляют собой повторяющиеся последовательности, которые присутствуют на концах хромосом; Их укорочение является характерной особенностью соматических клеток человека. Укорочение происходит из-за проблемы с репликацией концов и отсутствия фермента теломеразы, который отвечает за поддержание длины теломер. Интересно, что теломеры также укорачиваются в ответ на различные внутренние физиологические процессы, такие как окислительный стресс и воспаление, на которые могут влиять внеклеточные агенты, такие как загрязняющие вещества, инфекционные агенты, питательные вещества или радиация. Таким образом, длина теломер служит отличным биомаркером старения и различных физиологических параметров здоровья. Набор для анализа длины теломер TAGGG используется для количественного определения средней длины теломер с использованием анализа фрагмента рестрикции теломер (TRF) и обладает высокой воспроизводимостью. Однако это дорогостоящий метод, и из-за этого он обычно не используется для больших чисел выборки. Здесь мы описываем подробный протокол для оптимизированного и экономически эффективного измерения длины теломер с использованием Southern Blots или TRF-анализа и нерадиоактивного детектирования на основе хемилюминесценции.

Introduction

Теломеры - это повторяющиеся последовательности ДНК, присутствующие на концах хромосом. Они имеют тандемные повторы TTAGGG и поддерживают целостность генома, защищая хромосому как от износа, так и от проблемы репликации конца, что означает, что часть 3'-навеса не может быть реплицирована ДНК-полимеразой ^1,2. Короткие теломеры приводят к хромосомным аномалиям в клетках, из-за чего клетки постоянно останавливаются на стадии, называемой репликативным старением³. Короткие теломеры также вызывают множество других проблем, таких как дисфункция митохондрий ^4,5

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах, используемых в протоколе ниже. В таблице 1 перечислены лабораторные реагенты вместе с оптимизированными объемами, а в таблице 2 показаны рабочие концентрации коммерчес.......

Discussion

Мы подробно описываем процедуру нерадиоактивного, основанного на хемилюминесценции метода измерения длины теломер с использованием блоттинга Саузерна. Протокол был протестирован, чтобы обеспечить разумное использование нескольких реагентов без ущерба для качества результатов. Буф.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001