Modelo de neovascularização da córnea em camundongos por queimadura alcalina

Summary

Este protocolo enfoca a neovascularização corneana induzida por queimadura alcalina em camundongos. O método gera um modelo de doença corneana reprodutível e controlável para estudar a angiogênese patológica e os mecanismos moleculares associados e testar novos agentes farmacológicos para prevenir a neovascularização corneana.

Abstract

A neovascularização da córnea (CoNV), uma forma patológica de angiogênese, envolve o crescimento de vasos sanguíneos e linfáticos na córnea avascular a partir do limbo e afeta negativamente a transparência e a visão. A queimadura alcalina é uma das formas mais comuns de trauma ocular que leva à CoNV. Neste protocolo, a CoNV é induzida experimentalmente usando solução de hidróxido de sódio de forma controlada para garantir a reprodutibilidade. O modelo de queimadura alcalina é útil para o entendimento da patologia da CoNV e pode ser estendido para o estudo da angiogênese em geral devido à avascularidade, transparência e acessibilidade da córnea. Neste trabalho, a CoNV foi analisada por exame direto em microscópio dissecante e por imunomarcação de córneas de montagem plana usando anti-CD31 mAb. A linfangiogênese foi detectada em córneas planas por imunomarcação com anti-LYVE-1 mAb. O edema de córnea foi visualizado e quantificado pela tomografia de coerência óptica (OCT). Em resumo, este modelo ajudará a avançar os ensaios de neovascularização existentes e a descobrir novas estratégias de tratamento para a angiogênese ocular e extraocular patológica.

Introduction

A córnea é um tecido avascular que mantém sua transparência ao estabelecer um privilégio angiogênico1,2. Danos à córnea podem resultar em inflamação e desenvolvimento de vasos sanguíneos e linfáticos, além de fibrose³. A neovascularização da córnea (NVO) leva à deficiência visual e é a segunda causa de cegueira no^mundo4. A CoNV afeta cerca de 1,4 milhão de pessoas nos Estados Unidos por ano⁵. A NVco pode ser induzida por vários fatores, incluindo queimaduras químicas, infecções, inflamação e hipóxia ^3,6. As queimaduras químicas são uma das emergências oculares mais comuns, sendo responsáveis por cerca de 13,2% dos traumas oculares e requerem avaliação e tratamento^imediato7. As queimaduras químicas podem ser alcalinas ou ácidas, mas as alcalinas causam lesões mais graves, pois o álcali penetra mais profundamente no tecido⁸.

Modelos de camundongos de queimadura alcalina são amplamente utilizados para estudar CoNV e cicatrização de feridas. Comparados ao modelo de angiogênese de bolsa corneana ^9,10, os modelos de queimadura alcalina são relativamente simples de criar e também podem ser usados para estudar inflamação corneana, fibrose e proliferação epitelial. Esses modelos também estão mais relacionados às queimaduras químicas clínicas do que os modelos de sutura corneana de angiogênese11. Com queimadura alcalina, a córnea avascular desenvolve vasos sanguíneos devido à inflamação e a um desequilíbrio nos fatores antiangiogênicos e pró-angiogênicos ^1,2. As desvantagens dos modelos de queimadura alcalina corneana são as dificuldades no controle da área e gravidade da queimadura alcalina, a variação na neovascularização corneana e a queima não intencional dos tecidos adjacentes devido ao excesso de solução alcalina. O objetivo deste estudo é descrever um modelo controlado de queimadura alcalina corneana em camundongos utilizando papel de filtro pré-embebido em solução de hidróxido de sódio. Esse modelo poderia ser usado para estudar fatores angiogênicos, reagentes terapêuticos antiangiogênicos e outros fatores e reagentes que poderiam modular a inflamação e a fibrose.

Protocol

Todo o trabalho com animais, incluindo os procedimentos experimentais e a eutanásia, foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Baylor College of Medicine com o número de protocolo AN-8790.

1. Preparação de 1 N NaOH

1. Adicionar 4 mL de água deionizada estéril a um tubo centrífugo de 15 mL. Pesar 400 mg de hidróxido de sódio (NaOH) e adicionar ao tubo cuidadosamente.
2. Dissolva o NaOH agitando lentamente a solução usando uma haste de vidro. Completar o volume para 10 mL adicionando água deionizada estéril ao tubo e misturar novamente invertendo suavemente o tubo para cima e para baixo. Feche bem a tampa e guarde a solução à temperatura ambiente.
3. Prepare a solução fresca todos os meses porque a concentração da solução de NaOH pode ser reduzida pela solução que absorve dióxido de carbono no ar.
4. Misture sempre suavemente a solução de NaOH antes de usar.
   CUIDADO: Prepare a solução dentro de um exaustor químico e use equipamentos de proteção individual (EPIs) apropriados.

2. Preparação da solução de paraformaldeído (PFA) a 4%

1. Adicionar 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a um copo de vidro. Pese 4 g de paraformaldeído (PFA) e junte-o ao copo.
2. Mantenha o copo numa placa quente a 60 °C com agitação. Adicione a solução de NaOH 1 N gota a gota para elevar o pH até que a solução limpe.
3. Verificar e ajustar o pH para 7,4 utilizando 1 N de ácido clorídrico (HCl). Ajustar o volume final para 50 mL com 1x PBS.
4. Arrefecer e filtrar a solução. Conservar a solução a 4 °C.
   CUIDADO: Prepare a solução em um exaustor enquanto estiver usando EPI apropriado.

3. Preparação do coquetel de ketamina/xilazina

1. Preparar o coquetel de cetamina/xilazina adicionando 0,8 mL de cetamina (concentração estoque: 100 mg/mL) e 0,16 mL de xilazina (concentração estoque: 100 mg/mL) a 9,4 mL de solução salina.
2. Armazenar o cocktail em frascos de injeção estéreis à temperatura ambiente (TR).

4. Queimadura alcalina na córnea do rato

1. Injetar meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea 30 minutos antes do procedimento para alívio da dor. Anestesiar os camundongos (C57BL/6J, 6-8 semanas de idade, machos) usando uma injeção i.p. do coquetel cetamina/xilazina (Ketamina 80 mg/kg e Xilazina 16 mg/kg de peso corporal).
2. Verifique a resposta reflexa (retirada do pedal) apertando os dedos dos pés do mouse e confirme a ausência do reflexo. Aplicar uma gota de anestésico tópico, proparacaína a 0,5%, na superfície corneana de um olho e uma gota de lágrimas artificiais no outro olho.
3. Usando um punch de biópsia de 2 mm, perfure os discos de papel de filtro Whatman.
4. Adicionar 2 μL de NaOH 1N a uma placa de Petri limpa. Coloque o disco de papel filtro de 2 mm sobre a gota de NaOH de 1 N e deixe de molho por 15 s.
5. Pegue o papel filtro com pinça e aplique o papel filtro no olho tratado com proparacaína no centro da córnea por 30 s.
   OBS: O papel filtro deve estar tocando apenas o centro da córnea, e deve-se tomar cuidado para evitar a movimentação do papel filtro uma vez colocado, pois mover o papel filtro pode causar queimaduras nos tecidos adjacentes.
6. Lave o olho lavando com 20 mL de solução salina estéril em uma seringa estéril.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a córnea, juntamente com o saco conjuntival, seja lavada cuidadosamente para garantir que não haja mais danos à córnea ou ao tecido circundante. Lavar o saco conjuntival evitará ainda mais o simbléfaro.
7. Limpe suavemente o excesso de soro fisiológico dos olhos e da área circundante usando lenços descartáveis macios. Depois, mantenha os ratos em uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento aquecida até o deambulação.
   NOTA: Os ratos são monitorados diariamente após a queimadura alcalina por 3 dias. Se forem observados sintomas de dor ou stress, meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) é administrado por via subcutânea.

5. Exame e avaliação da neovascularização e opacidade

1. Em camundongos anestesiados, examinar os olhos sob um microscópio de dissecção no dia 10 após a queimadura e obter imagens usando uma câmera acoplada ao escopo de dissecção para pontuar a opacidade e a neovascularização.
   NOTA: Um escopo de dissecção regular com uma câmera conectada é suficiente.
2. Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a opacidade após a queimadura com base na seguinte^escala12:
   0 = Sem opacidade; córnea clara
   1 = Opacidade leve; ligeira nebulosidade nas áreas da íris e pupilas; íris e pupila facilmente visíveis
   2 = Opacidade moderada; íris e pupila pouco visíveis
   3 = Opacidade grave; íris ou pupila não visíveis
   4 = Córnea opaca; íris e pupila não visíveis
3. Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a CoNV com base na seguinte^escala12:
   0 = Sem neovascularização; ausência de novos vasos do limbo
   1 = Neovascularização leve; novos navios originários do limbo
   2 = Neovascularização moderada; vasos sanguíneos originados do limbo e crescendo em direção ao centro da córnea
   3 = Neovascularização grave; vasos sanguíneos que se originam do limbo e atingem e/ou atravessam o centro da córnea
4. Use o teste t de Student para comparar estatisticamente os escores de opacidade e neovascularização entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis.
5. Eutanasiar os camundongos no dia 10 por exposição ao isoflurano a 5% até 1 min após a parada respiratória, seguida de luxação cervical, e coletar as córneas para imagens de montagem plana.

6. Tomografia de coerência óptica (OCT)

1. Tire imagens de OCT do segmento anterior dos olhos em camundongos anestesiados no dia 10 após a queimadura. Realize a aquisição de imagens da OCT como uma varredura de volume usando o modo IR + OCT com um campo de visão de 30° e 100% de intensidade IR.
2. Quantifique a espessura das córneas utilizando o software ImageJ.
3. Para medir a espessura, use a ferramenta Seleção de linha no software ImageJ para criar uma linha reta entre as superfícies anterior e posterior na córnea central.
4. Clique em Analisar > Medir nas ferramentas de software para transferir os valores para a janela de dados.
5. Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a espessura da córnea entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.
   NOTA: A espessura da córnea é a distância de um ponto na superfície anterior da córnea até o ponto mais próximo na superfície posterior da córnea no centro da córnea.

7. Imunomarcação para CoNV em córneas planas

1. Eutanasiar os camundongos no dia 10 pós-queimadura alcalina e enuclear os olhos por dissecção romba.
2. Afaste as pálpebras usando os dedos polegar e indicador e coloque pinças sob o globo ocular. Feche a pinça e puxe suavemente o globo ocular para fora da órbita.
3. Coloque os globos oculares em 1x PBS. Para cada globo ocular, remova a córnea do globo ocular fazendo primeiro uma incisão usando uma agulha de 30 G abaixo da área do limbo.
4. Cortar ao redor da área do limbo usando microtesoura corneana, com a incisão como ponto de partida, e separar lentamente a córnea e o limbo do globo terrestre.
5. Limpe as córneas suavemente usando um pincel fino para remover a íris. Fixar as córneas em paraformaldeído a 4% por 1 h.
6. Lave as córneas três vezes por 20 min cada em 1x PBS à temperatura ambiente (TR).
7. Incubar em tampão de bloqueio (1x PBS suplementado com 0,1% de Triton-X 100 e 5% de albumina de soro bovino [BSA]) por 1 h no TR.
8. Transfira as córneas para uma solução de anticorpos contendo anticorpos primários. Preparar a solução de anticorpos em 1x PBS suplementado com BSA a 1%, Triton-X 100 a 0,1%, Dylight550-conjugado anti-CD31 mAb (1:100) e Alexa Fluor488-conjugado anti-LYVE-1 mAb (1:100).
9. Incubar durante 3 dias a 4 °C. Lave as córneas em 1x PBS três vezes por 20 min cada.
10. Manchar os núcleos usando solução de coloração Hoechst (1:1.000) por 5 min no escuro.
11. Achate as córneas com cortes radiais e monte-as em uma lâmina de vidro pré-limpa usando meio de montagem e lamínulas. Selar as lamínulas com esmalte transparente e secar as lâminas durante a noite no escuro antes da análise por microscopia confocal.
12. Imagem das córneas planas usando microscopia confocal costurando imagens individuais Z-stack; Use uma objetiva de 10x, lasers de 488 nm e 561 nm e uma resolução de 512 pixels x 512 pixels por fatia em scanners Galvano não ressonantes.
13. Quantifique a densidade dos vasos sanguíneos CD31+ e linfáticos LYVE-1⁺ usando o software ImageJ.
14. Para determinar a densidade vascular, converta as imagens confocais em uma imagem de 8 bits.
15. Escolha Densidade Vascular nos Plugins.
16. Escolha a região de interesse na imagem e clique em OK. As medições serão abertas em uma nova janela de dados.
17. Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a densidade vascular entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.
    NOTA: CD31, também chamada de molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias-1 (PECAM-1), é uma molécula de adesão celular envolvida na angiogênese e é altamente expressa nas células endoteliais de vasos sanguíneos precoces e maduros¹³. O LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) é um marcador de superfície celular em células endoteliais linfáticas e pode ser usado como marcador de linfangiogênese14.

Discussion

A córnea é um excelente tecido para o estudo da angiogênese e inflamação, pois é acessível e avascular, podendo ser convenientemente detectada e documentada a neovascularização. A queimadura da córnea em coelhos, ratos e camundongos tem sido utilizada para estudar a angiogênese corneana, inflamação e opacidade, ulceração, perfuração da córnea e fibrose^15,16,17. Além disso, o modelo de queimadura corneana em camundongos é valioso para testar várias estratégias terapêuticas para angiogênese e inflamação, pois camundongos possuem um sistema imunológico intimamente relacionado ao de humanos¹⁸. A disponibilidade de técnicas para manipular geneticamente o genoma de camundongos também torna a espécie uma excelente escolha para esse tipo de^estudo19. O desafio desta pesquisa foi desenvolver um método de queimadura corneana que forneça fisiopatologia consistente e reprodutível.

O modelo de queimadura alcalina é particularmente útil para a triagem farmacológica de drogas que modulam a angiogênese, inflamação e fibrose. Os requisitos mínimos de reagentes e recursos, a simplicidade de realizar a queima alcalina e os benefícios da curta duração do protocolo e da observação direta dos resultados tornam a queimadura alcalina na córnea de camundongos uma escolha primária para a triagem farmacológica de drogas. Entretanto, alguns cuidados devem ser considerados na realização desse procedimento para garantir consistência e reprodutibilidade. Em primeiro lugar, o papel de filtro deve ser colocado no centro da córnea para evitar queimar outras áreas do olho, especialmente o limbo, pálpebras e conjuntiva; em segundo lugar, o volume e a concentração de NaOH devem ser apropriados para obter resultados consistentes da queimadura alcalina na córnea. O filtro não deve estar a pingar molhado, mas deve ter sido embebido na solução de NaOH. O tamanho e o tipo de filtro e a normalidade e volume da solução utilizada neste método são otimizados para evitar um transbordamento de NaOH. O uso de papel de filtro de tamanhos diferentes ou de um volume maior ou menor de NaOH causaria inconsistências na neovascularização. Em terceiro lugar, é importante evitar que a solução de NaOH absorva CO₂ no ar ambiente, apertando imediatamente a tampa do tubo da solução após a utilização e reduzindo a relação ar/solução. Deve-se tomar cuidado com o uso de soluções alcalinas frescas para evitar inconsistências na neovascularização e evitar ulceração corneana. Finalmente, a lavagem extensiva de toda a solução de NaOH do olho e conjuntiva com soro fisiológico é necessária para evitar mais danos à córnea e aos tecidos circundantes do olho. A lavagem completa da córnea e dos tecidos adjacentes também evitará o simbléfaro.

O protocolo aqui descrito é um método eficiente e confiável para o estudo da fisiopatologia da angiogênese corneana. Este protocolo pode ser usado para estudar a inflamação da córnea, fibrose e cicatrização de feridas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira	KL-7302
30 G Needle	McKesson	16-N3005
A1R Confocal	Nikon Instruments
Anti-CD31	Novus Biologicals	NB100-1642R
Anti-LYVE-1	Life technologies	53-0443-82
ASM Module	Heidelberg Engineering		Anterior segment objective
Biopsy Punch	McKesson	16-1309
BSA	Thermoscientific	9048-46-8
Coverslip	VWR International	22X22-1-601640G
Dissection Microscope	AmScope	SM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Forceps	Fine Science Tools	15000-02
Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Forceps	Fisherbrand	12-000-157
Forceps	Roboz	RS-4905
Gonak Hypromellose	Akorn	17478006412
GraphPad Prism 9	GraphPad Sotware, Inc
Heating pad	K&H Pet Products	100213018
Hoescht	Life Technologies	62249
HRA + OCT Spectralis	Heidelberg Engineering
Insulin Syringe	Mckesson	102-SN310C31516P
Kimwipe	Kimberly Clark Professional	34155
Micro Cover Glass	VWR	48366-067
Microscissors	Roboz	RS-5110
Microscopic Slide	Fisherbrand	12-550-15
NaOH	Sigma Aldrich	55881-500G
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone	Bausch & Lomb	24208-0795-35
Normal Serum	Jackson Immuno	008-000-121
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127-500G
PBS	Gibco	20012-027
Proparacaine HCl	Bausch & Lomb	24208073006
Saline	Henry Schein	1531042
SMZ125	Nikon Instruments
Syringe 10 mL	McKesson	16-S10C
Triton X-100	Sigma Aldrich	TX1568-1
Whatmann Filter Paper	Cytiva	WHA1003323