Este protocolo enfoca a neovascularização corneana induzida por queimadura alcalina em camundongos. O método gera um modelo de doença corneana reprodutível e controlável para estudar a angiogênese patológica e os mecanismos moleculares associados e testar novos agentes farmacológicos para prevenir a neovascularização corneana.
A neovascularização da córnea (CoNV), uma forma patológica de angiogênese, envolve o crescimento de vasos sanguíneos e linfáticos na córnea avascular a partir do limbo e afeta negativamente a transparência e a visão. A queimadura alcalina é uma das formas mais comuns de trauma ocular que leva à CoNV. Neste protocolo, a CoNV é induzida experimentalmente usando solução de hidróxido de sódio de forma controlada para garantir a reprodutibilidade. O modelo de queimadura alcalina é útil para o entendimento da patologia da CoNV e pode ser estendido para o estudo da angiogênese em geral devido à avascularidade, transparência e acessibilidade da córnea. Neste trabalho, a CoNV foi analisada por exame direto em microscópio dissecante e por imunomarcação de córneas de montagem plana usando anti-CD31 mAb. A linfangiogênese foi detectada em córneas planas por imunomarcação com anti-LYVE-1 mAb. O edema de córnea foi visualizado e quantificado pela tomografia de coerência óptica (OCT). Em resumo, este modelo ajudará a avançar os ensaios de neovascularização existentes e a descobrir novas estratégias de tratamento para a angiogênese ocular e extraocular patológica.
A córnea é um tecido avascular que mantém sua transparência ao estabelecer um privilégio angiogênico1,2. Danos à córnea podem resultar em inflamação e desenvolvimento de vasos sanguíneos e linfáticos, além de fibrose3. A neovascularização da córnea (NVO) leva à deficiência visual e é a segunda causa de cegueira nomundo4. A CoNV afeta cerca de 1,4 milhão de pessoas nos Estados Unidos por ano5. A NVco pode ser induzida por vários fatores, incluindo queimaduras químicas, infecções, inflamação e hipóxia 3,6. As queimaduras químicas são uma das emergências oculares mais comuns, sendo responsáveis por cerca de 13,2% dos traumas oculares e requerem avaliação e tratamentoimediato7. As queimaduras químicas podem ser alcalinas ou ácidas, mas as alcalinas causam lesões mais graves, pois o álcali penetra mais profundamente no tecido8.
Modelos de camundongos de queimadura alcalina são amplamente utilizados para estudar CoNV e cicatrização de feridas. Comparados ao modelo de angiogênese de bolsa corneana 9,10, os modelos de queimadura alcalina são relativamente simples de criar e também podem ser usados para estudar inflamação corneana, fibrose e proliferação epitelial. Esses modelos também estão mais relacionados às queimaduras químicas clínicas do que os modelos de sutura corneana de angiogênese11. Com queimadura alcalina, a córnea avascular desenvolve vasos sanguíneos devido à inflamação e a um desequilíbrio nos fatores antiangiogênicos e pró-angiogênicos 1,2. As desvantagens dos modelos de queimadura alcalina corneana são as dificuldades no controle da área e gravidade da queimadura alcalina, a variação na neovascularização corneana e a queima não intencional dos tecidos adjacentes devido ao excesso de solução alcalina. O objetivo deste estudo é descrever um modelo controlado de queimadura alcalina corneana em camundongos utilizando papel de filtro pré-embebido em solução de hidróxido de sódio. Esse modelo poderia ser usado para estudar fatores angiogênicos, reagentes terapêuticos antiangiogênicos e outros fatores e reagentes que poderiam modular a inflamação e a fibrose.
Todo o trabalho com animais, incluindo os procedimentos experimentais e a eutanásia, foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Baylor College of Medicine com o número de protocolo AN-8790.
1. Preparação de 1 N NaOH
2. Preparação da solução de paraformaldeído (PFA) a 4%
3. Preparação do coquetel de ketamina/xilazina
4. Queimadura alcalina na córnea do rato
5. Exame e avaliação da neovascularização e opacidade
6. Tomografia de coerência óptica (OCT)
7. Imunomarcação para CoNV em córneas planas
Este estudo descreve um método para induzir angiogênese corneana no olho de camundongo por queimadura alcalina. As imagens obtidas com o microscópio de dissecção (Figura 1A,B) demonstraram escores de neovascularização e opacidade significativamente elevados nas córneas do grupo queimado alcalino (P < 0,05; Figura 1C,D). As córneas coletadas no 10º dia foram novamente imunomarcadas com anti-CD31 mAb para vasos sanguíneos e anti-LYVE-1 mAb para linfáticos, respectivamente (Figura 2A-I). O grupo queimadura alcalina apresentou densidades significativamente maiores de vasos sanguíneos e linfáticos após 10 dias (P < 0,001 e P < 0,05, respectivamente; Figura 2J,K). A espessura da córnea, imageada e quantificada pela OCT (Figura 3A,B), foi significativamente maior no grupo com queimadura alcalina (P < 0,01; Figura 3C).
Figura 1: Neovascularização e opacidade corneana induzida por queimadura alcalina. (A,B) A neovascularização da córnea brotou dos vasos do limbo em direção ao centro da córnea no olho de camundongo (A) queimado por álcali (B), mas não foi saudável 10 dias após a lesão. (C,D) Quantificação da (C) neovascularização corneana e (D) opacidade nos painéis A e B (± MEV; teste t; *P < 0,05; n = 3 olhos, 1 olho/rato). As setas vermelhas representam o limbo, e a seta amarela indica o surgimento de novos vasos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Neovascularização da córnea e linfangiogênese por queimadura alcalina. A imuno-histoquímica revelou vasos sanguíneos (A,D,G) e (B,E,H) utilizando os mAbs anti-CD31 e anti-LYVE-1, respectivamente. (A-C) A córnea de camundongo saudável. (D-I) A córnea alcalina-queimada 10 dias após a lesão. (C,F,I) Imagens sobrepostas de sinais CD31 e LYVE-1. (G-I) Imagens ampliadas para painéis D-F. Barras de escala = (A-F) 200 μm e (G-I) 500 μm. (J,K) Quantificação da densidade de vasos sanguíneos e linfáticos nos painéis A-F, conforme indicado (± MEV; teste t; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 olhos, 1 olho/rato). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aumento da espessura da córnea causado pela queimadura alcalina . (A) Uma imagem OCT de um olho de rato saudável. (B) Uma imagem de OCT da córnea de camundongo 10 dias após queimadura alcalina. (C) Quantificação da espessura corneana nos painéis A e B, medida no centro da córnea (± MEV; teste t; **P < 0,01; n = 3 olhos, 1 olho/rato). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A córnea é um excelente tecido para o estudo da angiogênese e inflamação, pois é acessível e avascular, podendo ser convenientemente detectada e documentada a neovascularização. A queimadura da córnea em coelhos, ratos e camundongos tem sido utilizada para estudar a angiogênese corneana, inflamação e opacidade, ulceração, perfuração da córnea e fibrose15,16,17. Além disso, o modelo de queimadura corneana em camundongos é valioso para testar várias estratégias terapêuticas para angiogênese e inflamação, pois camundongos possuem um sistema imunológico intimamente relacionado ao de humanos18. A disponibilidade de técnicas para manipular geneticamente o genoma de camundongos também torna a espécie uma excelente escolha para esse tipo deestudo19. O desafio desta pesquisa foi desenvolver um método de queimadura corneana que forneça fisiopatologia consistente e reprodutível.
O modelo de queimadura alcalina é particularmente útil para a triagem farmacológica de drogas que modulam a angiogênese, inflamação e fibrose. Os requisitos mínimos de reagentes e recursos, a simplicidade de realizar a queima alcalina e os benefícios da curta duração do protocolo e da observação direta dos resultados tornam a queimadura alcalina na córnea de camundongos uma escolha primária para a triagem farmacológica de drogas. Entretanto, alguns cuidados devem ser considerados na realização desse procedimento para garantir consistência e reprodutibilidade. Em primeiro lugar, o papel de filtro deve ser colocado no centro da córnea para evitar queimar outras áreas do olho, especialmente o limbo, pálpebras e conjuntiva; em segundo lugar, o volume e a concentração de NaOH devem ser apropriados para obter resultados consistentes da queimadura alcalina na córnea. O filtro não deve estar a pingar molhado, mas deve ter sido embebido na solução de NaOH. O tamanho e o tipo de filtro e a normalidade e volume da solução utilizada neste método são otimizados para evitar um transbordamento de NaOH. O uso de papel de filtro de tamanhos diferentes ou de um volume maior ou menor de NaOH causaria inconsistências na neovascularização. Em terceiro lugar, é importante evitar que a solução de NaOH absorva CO2 no ar ambiente, apertando imediatamente a tampa do tubo da solução após a utilização e reduzindo a relação ar/solução. Deve-se tomar cuidado com o uso de soluções alcalinas frescas para evitar inconsistências na neovascularização e evitar ulceração corneana. Finalmente, a lavagem extensiva de toda a solução de NaOH do olho e conjuntiva com soro fisiológico é necessária para evitar mais danos à córnea e aos tecidos circundantes do olho. A lavagem completa da córnea e dos tecidos adjacentes também evitará o simbléfaro.
O protocolo aqui descrito é um método eficiente e confiável para o estudo da fisiopatologia da angiogênese corneana. Este protocolo pode ser usado para estudar a inflamação da córnea, fibrose e cicatrização de feridas.
Este trabalho foi apoiado pela SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, e uma bolsa institucional irrestrita da Research to Prevent Blindness (RPB) para o Departamento de Oftalmologia, Baylor College of Medicine. W.L. é apoiado pela The Knights Templar Eye Foundation Endowment em Oftalmologia.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
Forceps | Roboz | RS-4905 | |
Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
PBS | Gibco | 20012-027 | |
Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
Saline | Henry Schein | 1531042 | |
SMZ125 | Nikon Instruments | ||
Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
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