Optimiser la procédure d’élevage des guêpes exemptes de germes

Résumé

Des embryons de guêpes Nasonia ont été disséqués à partir de pupes de Lucillia sericata après parasitation pendant 12 à 24 heures et lavés avec de l’alcool et une solution d’hypochlorite de sodium à 10% pour obtenir des embryons exempts de germes. Après avoir élevé les embryons exempts de germes et leur avoir fourni un milieu d’élevage Nasonia pour croître et se développer in vitro, des adultes de Nasonia exempts de germes ont été obtenus.

Résumé

La technologie d’élevage aseptique est une méthode d’élevage d’insectes dans des conditions stériles ou presque stériles, qui peut éliminer efficacement l’influence de micro-organismes externes sur le microbiote des insectes et ainsi favoriser le développement rapide de la recherche sur le microbiote des insectes. Nasonia (genre guêpe) est un insecte guêpe parasite qui présente de nombreux avantages, tels qu’une courte durée de vie, une variation génétique élevée, une utilisation facile, etc., et est largement utilisé comme système modèle d’insecte. Contrairement au traitement antibiotique, qui ne peut que réduire le nombre de micro-organismes chez les animaux, les techniques d’élevage aseptique peuvent contrôler à la fois la composition et la quantité de micro-organismes chez les animaux, facilitant ainsi l’étude des interactions hôte-microbe. Cependant, les versions précédentes du milieu d’élevage Nasonia (NRM) présentent certains défauts et problèmes, tels qu’un processus de préparation complexe et fastidieux, une contamination facile par des bactéries ou des champignons et un temps de stockage court. Par conséquent, cette étude résout ces problèmes en optimisant les outils utilisés dans le processus de préparation NRM, les conditions de stockage et les ratios de composants. Le milieu optimisé pourrait permettre un stockage à -20 °C pendant au moins 3 mois et éliminer la possibilité de contamination NRM lors de l’alimentation des guêpes stériles. Cela améliore encore le taux de survie et le niveau de santé de la nasonie aseptique, ce qui est important pour l’utilisation de Nasonia comme modèle pour la recherche microbienne.

Introduction

Les animaux exempts de germes sont des animaux qui n’ont pas de micro-organismes vivants détectables ni de parasites¹. Des embryons exempts de germes peuvent être obtenus en disséquant la mère dans des conditions aseptiques et ensuite élevés dans des systèmes de barrière². Ces animaux peuvent être utilisés pour étudier les effets des micro-organismes sur les animaux, tels que le microbiote intestinal, le système immunitaire et le métabolisme¹. Avec certains moyens techniques, de nombreux insectes et même mammifères peuvent être rendus stériles ^3,4. Les animaux exempts de germes ont un rôle unique et ont été largement utilisés dans divers aspects de la recherche en microbiologie⁵. Par exemple, l’utilisation de guêpes Nasonia exemptes de germes a révélé que les micro-organismes peuvent aider les hôtes à s’adapter à de nouveaux environnements soumis à un stress environnemental exogène à long terme ^6,7.

Les parasitoïdes Nasonia sont de petites guêpes parasites qui injectent leurs œufs dans les pupes des mouches⁴. Il existe quatre espèces connues de Nasonia, dont Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti et Nasonia oneida⁸. N. vitripennis est présent dans le monde entier, tandis que les trois autres espèces ont une aire de répartition limitée en Amérique du Nord⁴. Les guêpes parasitoïdes de Nasonia sont considérées comme des insectes modèles idéaux en raison de leurs caractéristiques, telles que la facilité de culture, le cycle de reproduction court, le génome séquencé et la diapause à long terme ^8,9. Ils peuvent être utilisés pour étudier divers aspects de l’évolution des insectes, de la génétique, du développement, du comportement et de la symbiose¹⁰. De plus, les guêpes parasitoïdes Nasonia peuvent également aider à contrôler les mouches nuisibles dans l’agriculture et les maladies¹¹. La mise en place réussie d’un système d’insectes stériles implique deux étapes principales: (1) stérilisation des embryons et (2) fourniture d’aliments stériles aux larves in vitro. Afin d’obtenir des aliments stériles, Brucker et Bordenstein 12 ont développé le milieu d’élevage Nasonia (NRMv1) en 2012 en utilisant des produits chimiques tels que des antibiotiques, de l’eau de Javel et du sérum bovin fœtal pour tuer les bactéries¹². Cependant, la méthode de stérilisation chimique a entraîné de faibles taux de survie et d’éclosion de N. vitripennis¹³. Puis, en 2016, Shropshire et al. ont développé NRMv2 en utilisant une méthode de stérilisation par filtre au lieu d’une méthode de stérilisation chimique pour éliminer les dangers des antibiotiques et d’autres substances, et ont optimisé le processus de sélection¹³. Malheureusement, cette méthode présente encore quelques inconvénients, tels que les défis associés à la préparation et à l’utilisation du milieu, ainsi que les risques de noyade, de sous-alimentation ou de déshydratation pour les embryons, les larves et les pupes fermées¹⁴. Wang et Brucker¹⁴ ont récemment amélioré les protocoles Nasonia rearing media version 3 (NRMv3) et les protocoles d’élevage sans germes version 2 (GFRv2). Ces améliorations ont permis de réduire les coûts et la consommation de médias. Cependant, le NRMv3 a une durée de stockage très courte et est très sensible à la contamination.

En s’appuyant sur NRMv3, la méthode de stockage des outils de préparation NRM et le ratio nutritionnel ont été optimisés dans cette étude. Ce raffinement méthodologique facilite l’utilisation de N. vitripennis comme modèle pour les études sur le microbiome. Comparé au NRMv3 développé par Wang et al.14, l’outil amélioré pour presser la chrysalide Sarcophaga bullata, l’une des matières premières NRM, améliore considérablement l’efficacité de production du liquide tissulaire de S. bullata pupa par rapport à la seringue de 60 ml avec un trou de fond utilisée par Wang et ^al.14. Nous avons ajusté le ratio de nutriments de NRM, ce qui a conduit à une certaine augmentation du taux de survie des guêpes Nasonia exemptes de germes sans affecter leur temps de développement. De plus, le NRM a été emballé dans des tubes centrifugés de petite capacité (1,5 mL) et congelé dans un réfrigérateur à -20 °C pour prolonger la durée de stockage. Il convient de noter que bien que nous ayons utilisé la mouche domestique Lucilia sericata comme hôte et source pour la préparation du NRM, ce protocole peut probablement être adapté à d’autres hôtes Nasonia disponibles en laboratoire.

Protocole

1. Préparation d’un milieu d’élevage Nasonia exempt de germes 

1. Placez les pupes de L. sericata disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) sur une surface pouvant accueillir toutes les nymphes, comme un plateau ou une feuille de papier. Jetez les larves sous-développées, les vieilles pupes sombres, les coquilles de nymphes vides, la sciure de bois ou d’autres impuretés. Ne gardez que les jeunes pupes de couleur rouge brunâtre et transférez-les dans un bécher (environ 3 000 à 4 000 nymphes).
   REMARQUE: Après avoir mené de nombreuses expériences, il a été constaté que le milieu fabriqué à partir des vieilles pupes sombres devenait facilement sombre et arrêtait le développement de guêpes exemptes de germes. Ce phénomène ne s’est pas produit lors de l’utilisation des jeunes pupes brun-rouge pour produire du milieu. La raison de cette situation n’est toujours pas claire et nécessite une enquête plus approfondie pour la vérifier.
2. Ajouter suffisamment d’eau désionisée dans le bécher pour couvrir toute la surface des nymphes. Enveloppez la bouche du bécher avec du papier d’aluminium ou de la gaze, secouez le bécher pour nettoyer les impuretés à la surface des nymphes, puis versez l’eau. Répétez trois à cinq fois.
3. Placer les pupes de L. sericata nettoyées dans le réservoir filtrant d’une presse à ail, presser fort et recueillir le liquide tissulaire des pupes de L. sericata dans un tube centrifuge stérile de 50 mL. Ensuite, versez la lie de pupe et mettez de nouvelles pupes dans le réservoir filtrant de la presse à ail jusqu’à ce qu’elles soient toutes pressées.
   REMARQUE: Comparé au dispositif d’extrusion à aiguille utilisé par Wang et ^al.14, la presse à ail est plus pratique et peut séparer le liquide interstitiel plus complètement. Cette avancée jette les bases d’une production à grande échelle et d’un stockage à long terme de NRM.
4. Centrifuger le mélange à 4 °C (25 000 x g) pendant 10 min. Après centrifugation, le mélange sera séparé en trois couches de bas en haut : couche de sédiments, couche de protéines et couche de graisse (Figure 1).
5. Pour éviter le colmatage pendant la filtration, aspirez la couche de protéines à l’aide d’une aiguille stérile de 18 G et transférez-la dans un nouveau tube centrifuge conique stérile en polypropylène de 50 mL.
6. Ajouter le milieu liquide commercial de la drosophile (voir le tableau des matières) à l’extrait protéique dans un rapport de 1:1.
   REMARQUE : Une L. sericata commercialisée plus pratique a été utilisée comme matière première hôte et NRM, comparativement à la NRMv3. Par conséquent, le rapport nutritionnel a été ajusté de 1:2 à 1:1 sur la base de NRMv3, qui était plus approprié pour la croissance et le développement de Nasonia stérile (Figure 2).
7. Filtrer le milieu mixte (milieu de drosophile et extrait protéique de la chrysalide de L. sericata ) à l’aide d’un système de filtration sous vide avec différentes tailles de pores (8, 1,2, 0,8 et 0,45 μm; voir le tableau des matériaux) pour éliminer les particules de différentes tailles. Pour éviter le colmatage, changez le papier filtre lorsque le débit ralentit.
   REMARQUE : L’utilisation d’un nouveau tube centrifuge stérile de 50 ml est requise pour chaque filtration.
8. Centrifuger à nouveau le liquide à 4 °C (15 000 x g) pendant 10 min et stériliser le milieu surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Répétez les étapes ci-dessus une fois.
9. Entreposer le milieu de culture à -20 °C après aliquote (figure 3A) en vue d’un stockage à long terme.
   NOTA : Pour prévenir la contamination et la congélation et la décongélation répétées, il est recommandé d’ouvrir chaque tube de NRM une seule fois lors de l’utilisation du milieu de culture après l’emballage (figure 3A).

2. Collecte d’œufs sans germes

1. Pour assurer un rapport mâle-femelle stable chez la progéniture, placer les pupes dans un flacon de drosophile au stade nymphal à un ratio de 50 femelles pour 15 mâles en raison de leurs caractéristiques génétiques haploïdes (les mâles se développent à partir de cellules haploïdes, tandis que les femelles se développent à partir de cellules diploïdes résultant d’œufs fécondés)^4,15.
   1. Après avoir émergé aux adultes, laissez les mâles et les femelles s’accoupler pendant 1,5 jour, puis mettez environ 40 pupes L. sericata dans le flacon. Dans les 12 à 24 heures suivant la parasitation, utilisez une aiguille de dissection stérile pour ouvrir soigneusement une extrémité de la coquille nymphale au stéréomicroscope (figure 4).
   2. Tenez l’autre extrémité à la main et trouvez les embryons de guêpe. Utiliser une aiguille à dissection pour transférer les embryons de la surface du tissu de la nymphe L. sericata vers une passoire à cellules stériles avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)¹⁴.
      REMARQUE : Les pupes L. sericata plus âgées doivent être utilisées pour le parasitisme, car le tissu sec de la nymphe de L. sericata est plus facile à transférer des embryons. Afin d’assurer le transfert en douceur des œufs de la surface du tissu de la nymphe L. sericata , essayez de ne pas percer le tissu lorsque l’aiguille de dissection ouvre le boîtier nymphal afin que le liquide interstitiel ne s’écoule pas.
2. Placez 20 à 30 embryons sur une passoire cellulaire et lavez-les uniformément avec 1 000 μL de solution commerciale d’hypochlorite de sodium à 10 % (voir le tableau des matières), suivi d’un autre lavage avec 1 000 μL de PBS 1x stérile. Ensuite, laver une fois avec 1 000 μL de solution d’éthanol à 70% et laver trois fois avec 1 000 μL de PBS 1x stérile.
3. Tout d’abord, placez une feuille de maille de polypropylène de 5 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux) qui a été pré-mouillée avec 1x PBS dans une plaque de 24 puits. Ensuite, à l’aide d’une petite brosse stérilisée, badigeonner doucement les embryons de guêpe sur la passoire cellulaire sur la feuille de maille en polypropylène. Cela peut être fait pour les quatre puits dans une colonne verticale de la plaque de 24 puits.

3. Élevage de guêpes exemptes de germes

1. Ajouter 50 μL de NRM à chaque puits dans une hotte à flux laminaire. Pour maintenir un environnement humide propice à la croissance, ajoutez 1 mL d’eau stérile entre chaque puits dans la plaque de 24 puits. Un petit bécher contenant 30 ml d’eau stérile peut également être placé dans la boîte en plastique stérile de 5 L avec la plaque de 24 puits.
   1. Tout au long de l’expérience, conservez la boîte en plastique stérile et la plaque de 24 puits dans une chambre climatique à une température constante de 25 ± 2 °C et sous une lumière constante.
2. Avant de transférer et d’ajouter NRM tous les jours, décongelez le NRM congelé sur un banc d’écoulement laminaire. Dans un environnement stérile, utilisez une pince à épiler désinfectée à l’alcool pour transférer le treillis de polypropylène contenant les larves d’un puits à un autre. Enfin, ajoutez 50 μL de NRM qui a été équilibré à température ambiante (Figure 3B). Répétez les opérations ci-dessus tous les jours jusqu’à ce que les pupes soient observées.
   REMARQUE: Avec le développement des guêpes, la quantité de NRM devrait être augmentée de manière appropriée pour s’assurer que les guêpes exemptes de germes ont une nutrition suffisante. Par exemple, les larves du quatrième stade ont reçu de 60 à 70 μL de NRM. Étant donné que différents stades de développement peuvent coexister dans le même puits, utilisez une brosse stérilisée pour transférer les nymphes. Ajouter une petite quantité de NRM aux larves restantes. Utilisez des techniques aseptiques pour éviter l’invasion microbienne et la pollution.
3. Après s’être nourries pendant 9 à 11 jours, plus de 80% des larves se développent en nymphes blanches ou jaunes. À ce stade, déplacez le filtre dans une plaque de puits propre et arrêtez d’ajouter du milieu de culture pour attendre l’éclosion.

Résultats

L’efficacité de préparation de NRM a été grandement améliorée par l’amélioration des outils de préparation. En outre, le problème de la pollution NRM dans le processus d’alimentation a été éliminé en optimisant la stratégie et la méthode de conservation. Dans le même temps, le NRM ajusté avait un rapport nutritionnel plus approprié pour la croissance et le développement de guêpes exemptes de germes avec L. sericata comme hôtes. Le taux de survie des guêpes exemptes de germes des larve...

Discussion

Avec l’application de technologies de détection à haut débit telles que la génomique et la métabolomique, les chercheurs ont progressivement réalisé qu’il existe une grande diversité génétique et une grande complexité métabolique dans le microbiote intestinal¹⁶. Ces bactéries symbiotiques sont étroitement liées à divers états physiologiques ou pathologiques, tels que le métabolisme nutritionnel de l’hôte, les tumeurs, l’immunité et le vieillissement par le biais d’int...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56