חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

Summary

הפרוטוקול מתאר כיצד חרוזי פיצוי מבוססי פורפירין עבור ציטומטריית זרימה מוכנים על ידי התגובה של חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמין עם TCPP פורפירין ומגיב צימוד אמיד EDC. הליך סינון משמש כדי להפחית את תוצרי הלוואי של החלקיקים.

Abstract

ציטומטריית זרימה יכולה לאפיין ולכמת במהירות אוכלוסיות תאים מגוונות בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות. התאים מוכתמים תחילה בריאגנטים פלואורסצנטיים אחד או יותר, כאשר כל אחד מהם מתפקד עם מולקולה פלואורסצנטית אחרת (פלואורופור) הנקשרת לתאים באופן סלקטיבי בהתבסס על המאפיינים הפנוטיפיים שלהם, כגון ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא. את עוצמת הפלואורסצנטיות מכל מגיב הקשור לתאים ניתן למדוד על ציטומטר הזרימה באמצעות ערוצים המזהים טווח מוגדר של אורכי גל. כאשר משתמשים בפלואורופורים מרובים, האור מפלואורופורים בודדים גולש לעתים קרובות לתעלות גילוי לא רצויות, מה שדורש תיקון לנתוני עוצמת הפלואורסצנטיות בתהליך שנקרא פיצוי.

חלקיקי בקרת פיצוי, בדרך כלל חרוזי פולימר הקשורים לפלואורופור יחיד, נדרשים עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי תיוג תאים. נתונים מחלקיקי פיצוי מציטומטר הזרימה משמשים ליישום תיקון למדידות עוצמת הפלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה וטיהור של חרוזי פיצוי פוליסטירן המתפקדים באופן קוולנטי עם מגיב פלואורסצנטי מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין (TCPP) ויישומם בפיצוי ציטומטריית זרימה. בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו באמצעות TCPP ומגיב צימוד אמיד EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) ב- pH 6 ובטמפרטורת החדר במשך 16 שעות עם תסיסה. חרוזי TCPP בודדו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש במאגר pH 7 לאחסון. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו כתוצר לוואי. ניתן להפחית את מספר החלקיקים הללו באמצעות פרוטוקול סינון אופציונלי. חרוזי TCPP שהתקבלו שימשו בהצלחה על ציטומטר זרימה לפיצוי בניסויים עם תאי כיח אנושיים שסומנו עם פלואורופורים מרובים. חרוזי TCPP הוכחו כיציבים לאחר אחסון במקרר במשך 300 יום.

Introduction

פורפירינים היו בעלי עניין במשך שנים רבות בתחום הביו-רפואי בשל תכונותיהם הפלואורסצנטיות וממוקדות הגידול ^1,2,3. יישומים טיפוליים כגון טיפול פוטודינמי (PDT) וטיפול סונודינמי (SDT) כרוכים במתן סיסטמי של פורפירין לחולה סרטן, הצטברות התרופה בגידול וחשיפה מקומית של הגידול לאור לייזר באורך גל מסוים או אולטרסאונד. החשיפה לאור לייזר או אולטרסאונד מובילה ליצירת מיני חמצן תגובתי על ידי הפורפירין ולאחר מכן למוות תאי ^4,5. באבחון פוטודינמי (PDD), פורפירין פלואורסצנטי משמש להבדיל בין תאים סרטניים לתאים נורמליים⁶

Protocol

כל ההליכים צריכים להיעשות באמצעות ציוד מגן אישי מתאים.

1. הכנת תמיסת מלאי TCPP, 1.0 מ"ג / מ"ל

הערה: ניתן להכין זאת אחת לחודש.

1. בעזרת איזון אנליטי, מרית ונייר שקילה, שוקלים 49.0-50.9 מ"ג TCPP. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם. הניחו בצד את הכמות הנמדדת של TCPP המוגנת מ?.......

Discussion

למרות היישומים הרבים של פורפירינים באבחון סרטן וטיפולים², קיימת ספרות מוגבלת על השימוש הפוטנציאלי שלהם כמגיב ציטומטרי זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים סרטניים לעומת לא סרטניים ברקמות אנושיות ראשוניות^24,25,26. המחקר שלנו על ניתוח צ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365