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この記事について

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要約

このプロトコルでは、アミン官能化ポリスチレンビーズとポルフィリンTCPPおよびアミドカップリング試薬EDCとの反応によって、フローサイトメトリー用のポルフィリンベースの補償ビーズがどのように調製されるかについて説明しています。ろ過手順は、粒子状の副産物を減らすために使用されます。

要約

フローサイトメトリーは、蛍光測定に基づいて多様な細胞集団を迅速に特性評価および定量することができます。細胞はまず1つ以上の蛍光試薬で染色され、それぞれが異なる蛍光分子(蛍光色素)で機能化され、細胞表面抗原発現などの表現型特性に基づいて細胞に選択的に結合します。細胞に結合した各試薬からの蛍光強度は、指定された範囲の波長を検出するチャネルを使用してフローサイトメーターで測定できます。複数の蛍光色素を使用する場合、個々の蛍光色素からの光が望ましくない検出チャンネルにこぼれることが多く、補正と呼ばれるプロセスで蛍光強度データを補正する必要があります。

補償対照粒子(通常は単一の蛍光色素に結合したポリマービーズ)は、細胞標識実験で使用される各蛍光色素に必要です。フローサイトメーターからの補償粒子からのデータは、蛍光強度測定に補正を適用するために使用されます。このプロトコルでは、蛍光試薬メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン(TCPP)で共有結合的に官能基化されたポリスチレン補正ビーズの調製と精製、およびフローサイトメトリー補正への応用について説明します。本研究では,アミン官能化ポリスチレンビーズをTCPPとアミドカップリング試薬EDC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)でpH 6,室温で16時間撹拌しながら処理した。TCPPビーズを遠心分離により単離し、保存のためにpH7緩衝液に再懸濁した。TCPP関連の微粒子が副産物として観察された。これらの微粒子の数は、オプションのろ過プロトコルを使用して減らすことができます。得られたTCPPビーズは、複数の蛍光色素で標識されたヒト喀痰細胞を用いた実験において、補正のためにフローサイトメーターでうまく使用されました。TCPPビーズは、冷蔵庫で300日間保存した後、安定であることが証明されました。

概要

ポルフィリンは、その蛍光特性と腫瘍標的特性により、生物医学分野で長年にわたって関心を集めてきました1,2,3。光線力学療法(PDT)およびソノダイナミック療法(SDT)などの治療用途は、癌患者へのポルフィリンの全身投与、腫瘍における薬物の蓄積、および特定の波長のレーザー光または超音波への腫瘍の局所的曝露を伴う。レーザー光または超音波への曝露は、ポルフィリンによる活性酸素種の生成とそれに続く細胞死につながります4,5。光線力学的診断(PDD)では、ポルフィリン蛍光を使用して癌細胞と正常細胞を区別します6。これに関連して、プロトポルフィリンIXは、その前駆体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の全身または局所注射時に腫瘍に蓄積する天然の蛍光ポルフィリンであり、消化管間質腫瘍、膀胱癌、および脳腫瘍を特定するために使用されます7,8。最近では、多発性骨髄腫における最小限の残存病変を検出するためのアプローチとして5-ALA治療が検討された9。当研究室では、テトラアリールポルフィリンTCPP(5,10,15,20-テトラキス-(4-カルボキシフェニル)-21,23H-ポルフィン)を用いており、ヒト喀痰検体中の肺がん細胞やがん関連細胞を選択的に染色することができ、スライドベースやフローサイトメトリー診断アッセイで利用されている特性です10。

いくつかのポルフィリンは、治療薬および診断薬として使用できるという点で二機能性である2,11。生物医学研究では、このような二官能性ポルフィリンを使用して、癌細胞を選択的に標的にして殺す能力がそれらの構造の関数であり、他の化合物の存在によってどのように影響を受けるかを評価します12、13、14、15、16。ポルフィリンの細胞内取り込みとその細胞毒性の両方を、フローサイトメトリープラットフォームでハイスループットな方法で測定できます。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルと発光スペクトルは複雑ですが、ほとんどのフローサイトメトリープラットフォームはそれらを正しく識別するために装備されています。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルは、ソーレー帯として知られる380〜500nmの範囲の強い吸収帯によって特徴付けられる。一般に、500〜750 nmの範囲(Qバンド)で2〜4個の弱い吸収バンドが観察されます17。ほとんどのフローサイトメーターに存在する青色の488 nmレーザー、または紫色レーザー(405 nm)は、ポルフィリンを励起するための適切な波長の光を生成できます。ポルフィリンの発光スペクトルは通常、600〜800 nmの範囲にピークを示し18、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリン(PE)フルオロフォアとのスペクトルオーバーラップはほとんどありませんが、アロフィコシアニン(APC)などの他のよく使用されるフルオロフォアや、PE-Cy5などのタンデムフルオロフォアとはかなり重複します。したがって、マルチカラーフローサイトメトリーアッセイでポルフィリンを使用する場合、ポルフィリンの蛍光を測定するために指定されたチャネル以外のチャネルでの蛍光のスピルオーバーを適切に補正するには、シングルフルオロフォアコントロールが不可欠です。

理想的には、蛍光色素パネルのスピルオーバーマトリックスの計算に使用される単一蛍光色素コントロール(「補正コントロール」とも呼ばれます)は、サンプルと同じ細胞タイプで構成されている必要があります。ただし、そもそもサンプルが非常に少ない場合、またはサンプル内のターゲット集団が非常に少ない場合(たとえば、病気の初期段階で最小限の残存疾患または癌細胞を調べたい場合)は、この目的でサンプルを使用することは最適ではありません。細胞の有用な代替物は、サンプルの分析に使用されるのと同じ蛍光色素と結合されたビーズです。そのようなビーズの多くは市販されている。これらのビーズは、目的の蛍光色素で事前に標識されているか(標識済み蛍光色素特異的ビーズ)19,20、または蛍光標識された抗体をそれらに付着させることができます(抗体捕捉ビーズ)20,21。市販の補正ビーズは多くの蛍光色素に利用できますが、このようなビーズは基礎研究や臨床研究での使用が増加しているにもかかわらず、ポルフィリンには利用できません。

サンプルの保存と適切なサイズのポジティブ集団とネガティブ集団に加えて、ビーズを補償コントロールとして使用する他の利点は、調製の容易さ、低バックグラウンド蛍光、および長期にわたる優れた安定性です22。ビーズを補償コントロールとして使用することの潜在的な欠点は、ビーズに捕捉された蛍光抗体の発光スペクトルが、細胞の標識に使用される同じ抗体の発光スペクトルと異なる可能性があることです。これは、スペクトルフローサイトメーター20を使用する場合に特に重要であり得る。したがって、補償制御としてのビーズの開発は、ビーズが開発されるアッセイに使用されるフローサイトメーター上で行われる必要がある。さらに、ビーズの開発には、同じ蛍光染色試薬で標識された細胞との比較を含める必要があります。

ここでは、検出チャネル内の蛍光強度の中央値が喀痰中のTCPP標識細胞と同等であったTCPPアミン官能化ポリスチレン補正ビーズの調製と、フローサイトメトリーの補正コントロールとしての使用について説明します。同等の非官能化ビーズの自家蛍光は、負の蛍光補償対照として使用するには十分に低かった。さらに、これらのビーズは、ほぼ1年間の貯蔵安定性を示しました。

プロトコル

すべての手順は、適切な個人用保護具を使用して行う必要があります。

1. TCPP原液の調製 1.0 mg/mL

注:これは毎月準備できます。

  1. 分析天びん、へら、および計量紙を使用して、49.0〜50.9 mgのTCPPを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。測定された量のTCPPを光から保護しておきます。
    注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。
  2. ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から精製水とイソプロパノール(IPA)の必要量を決定します。精製水とイソプロパノールを100 mLのガラスビーカーに加え、蒸発から保護するためにパラフィルムで覆います。
  3. ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から重炭酸ナトリウムの必要量を決定します。
  4. 分析天びん、ヘラ、および計量紙を使用して、ステップ1.3で決定した必要量の重炭酸ナトリウムを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。
    注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。
  5. 精製水とイソプロパノールを含む100mLビーカーに重炭酸ナトリウムを加えます。蒸発から保護するために溶液をパラフィルムで覆います。
  6. ステップ1.5の溶液を攪拌プレートに置き、溶解するまで攪拌します(約10分)
  7. pHを測定して、ステップ1.6の重炭酸ナトリウム含有溶液のpHが9〜10であることを確認します。
  8. ステップ1.1で秤量したTCPPをステップ1.7の溶液にゆっくりと加え、溶解するまで攪拌を続けます(~30分)。このステップ中は光から保護してください。
  9. ガラス製またはポリプロピレン製の容器に室温で保管し、光から保護してください。

2. 2-(N -モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)およびヘミナトリウム塩緩衝液、0.1 M、pH 6.0-6.2(「MES緩衝液」)の調製

注意: これは使用日に準備し、室温に保つ必要があります。

  1. MESヘミナトリウム塩2.50gを量り、150mLのペットボトルに加えます。
  2. 精製水121 mLを加え、固形物が見えなくなるまで手動で振とうして溶解します。
  3. MESバッファーのpHを測定して、6〜6.2であることを確認します。
  4. 同じ日に使用するために室温に維持してください。

3. N-(3-ジメトリアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)粉末

  1. EDCパウダーを冷凍庫から取り出し、手順5で使用するまで室温で放置します。

4. アミン官能化ポリスチレンビーズとTCPP溶液の組み合わせ

  1. ステップ2で調製した0.1 M MES緩衝液4.3 mLを15 mLポリプロピレンチューブに加えます。
  2. アミン官能化ポリスチレンビーズ懸濁液(10 μm、2.5% w/v)を最高速度で60秒間ボルテックスします。
  3. この新たにボルテックスしたビーズ懸濁液288 μLをステップ4.1のMESバッファーに加えます。
  4. MES/ビーズ溶液を最大速度で15秒間ボルテックスします。
  5. ステップ1で調製した1 mg/mL TCPP溶液を最大速度で60秒間ボルテックスします。
  6. この新たにボルテックスしたTCPPストック溶液1.20 mLを、ステップ4.4のMES/ビーズ懸濁液に加えます。
  7. MES/ビーズ/TCPPサスペンションを最高速度で15秒間ボルテックスします。
  8. EDC溶液を調製している間、チューブをホイルで覆います。

5. N-(3-ジメトリアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)ヒドロコロリド(HCl)原液の調製

注意: EDC溶液は腐りやすいため、調製後すぐに使用する必要があります。

  1. 20.0 mLの精製水を新しい50 mLコニカルチューブに追加します。
  2. ステップ3で200mgのEDC HClを量り、水に加えます(ステップ5.1)。
  3. EDC HCLを最大速度で15秒間ボルテックスして、明確なソリューションを生成します。

6. EDC HCl/MESワーキングソリューションの調製

注意: EDC HCl / MES溶液は腐りやすいため、調製後すぐに使用する必要があります。

  1. 54.0 mLのMES緩衝溶液(ステップ2で調製)を150 mLのペットボトルに追加します。
  2. 6.0 mLのEDC HClストック溶液(ステップ5で調製)をMES緩衝液に加え、10秒間振とうして混合します。

7. TCPPによるビーズの標識

  1. ビーズとTCPPを含む15 mLのポリプロピレンチューブに4.5 mLのEDC作業溶液(ステップ6から)をMESバッファーに加えます(ステップ4.7)。
  2. チューブを35rpmの反転ローテーターに室温で16時間置き、光から保護します。
  3. チューブを室温で1,000 × gで10分間遠心分離します。
  4. 上清を吸引し、ビーズを0.8 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に再懸濁します。
  5. ビーズ溶液を1 mLピペットで琥珀色のポリプロピレンバイアルに移し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
    注:この時点で、ビーズは少なくとも3か月間安定しています。

8. フローサイトメトリーによるTCPPビーズの品質チェック(QC)

注:QCは、TCPPビーズの蛍光強度の中央値(MFI)が、使用目的と手順によって生成される微粒子の量に対して十分に明るいかどうかに集中する必要があります。詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。

  1. 1本の5 mLポリスチレンチューブに「TCPPネガティブビーズ」というラベルを付けます。
    注:ネガティブビーズは、ラベリングに使用されるアミン官能化ビーズとは異なります。 材料表を参照してください。
  2. 別のチューブに「TCPPポジティブビーズ」というラベルを付けます。
  3. 別のチューブに「レインボービーズ」というラベルを付けます。
  4. 300 μLの氷冷HBSSを「TCPP陰性ビーズ」および「TCPP陽性ビーズ」でラベル付けされたチューブに分注します。
  5. 氷冷したHBSSを500μLの「レインボービーズ」とラベル付けされたチューブに加えます。
  6. 非官能化ポリスチレン(ラベルなし)ビーズ懸濁液を最高速度(2〜3秒)で短時間ボルテックスし、「TCPPネガティブビーズ」とラベル表示されたチューブに10μLを加えます。
  7. TCPP標識ビーズ懸濁液(ステップ7.5で完成)を最高速度で短時間ボルテックスし、3 μLを「TCPP陽性ビーズ」チューブに追加します。
  8. レインボービーズサスペンションを最高速度で短時間ボルテックスし、「レインボービーズ」チューブに2滴加えます。
  9. すべてのチューブを氷の上に置き、覆い、光から保護してください。
  10. フローサイトメーターの適切な毎日の起動手順を開始し、QCを実行して最適な流体とレーザーアライメントを検証します。
    注:プロトコルのこの部分では、オペレーターは、光散乱と蛍光強度を標準化する手順、および正しい補償マトリックスを計算する基本原則を含む、利用可能なフローサイトメーターの使用について訓練されていることを前提としています。
  11. レインボービーズとTCPPビーズは、異なる実行の間に電圧設定を変更せずに実行します。
    1. レインボービーズのイベントを10,000回実行して収集します。
    2. 水ですすぎを行い、TCPP陰性ビーズのイベントを10,000回収集します。
    3. 水ですすぎを行い、TCPP陽性ビーズのイベントを10,000回収集します。
    4. 1分間の水すすぎを行います。
      注意: TCPPビーズを実行した後は、水ですすぐことが重要です。TCPPがサイトメーターのラインから洗い流されない場合、残留TCPPが次に取得されるチューブ内の細胞を標識できる可能性がある。
    5. サイトメーターの製造元の指示に固有の適切なクリーニングおよびシャットダウンプロトコルを実行します。
      メモ: 代表的な結果については、 図 1 を参照してください。

9.ビーズろ過

注:フローサイトメトリー(ステップ8)によるビーズのQCが高い割合(70%以上)を示している場合は、以下のプロトコルを使用してビーズ懸濁液をろ過することを検討してください(図2)。

  1. ステップ7.5で終了した0.8 mLのTCPPビーズ懸濁液に3.20 mLの氷冷HBSSを加えます(5倍希釈を作成します)。
  2. 希釈したビーズ懸濁液を最高速度で15秒間ボルテックスします。
  3. 使い捨ての5mLシリンジからプランジャーを取り外します。
  4. シリンジにガラス繊維チップフィルター(5 μm、直径13 mm)を取り付けます。
  5. 4 mLのHBSSをシリンジに加えます。
  6. ボルテックス希釈ビーズ懸濁液0.5 mLを加えます(ステップ9.2)。
  7. プランジャーを使用して、シリンジ/フィルターのセットアップで懸濁液を約2滴/秒でろ過します。
  8. 5 mLの新しいHBSSをフィルターを通して約2滴/秒でシリンジに引き込み、ビーズを洗浄します。
  9. HBSSを約2滴/秒で廃棄物容器に再度押し出します。
  10. フィルターからビーズを取り除くには、フィルターを通してさらに5 mLの新しいHBSSをシリンジに引き込みます。
  11. シリンジからフィルターを慎重に取り外します。
  12. ビーズ懸濁液をシリンジから50 mLの円錐形遠心管に排出します。
  13. フィルターをシリンジに戻し、手順9.10〜9.12をさらに4回繰り返します。次に、フィルターとシリンジを廃棄します。
  14. 手順9.2のすべてのビーズがろ過されるまで、手順9.1〜9.13を繰り返します。毎回新しい注射器とフィルターを使用してください。
  15. ろ過したビーズ懸濁液を室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。
  16. 各50 mLチューブの上清を吸引し、ビーズを穏やかに再懸濁し、0.5 mLの新鮮なHBSSに混ぜ合わせます。
  17. p1,000マイクロピペットでビーズを新しい琥珀色、ガラス、またはポリプロピレンのバイアルに移し、4°Cで保存します。
  18. ステップ8を繰り返して、ろ過されたビーズ懸濁液中のTCPP関連微粒子の割合が減少したかどうかを判断します。代表的な結果については、 図 3 を参照してください。

結果

ビーズのTCPPラベリングのためのこのプロトコルは、比較的高速で効率的です。図1は、フローサイトメトリーによって決定されたTCPPビーズ標識プロセスの代表的な結果を示す。図1Aは、TCPPを検出するための適切なチャネルで検出されたレインボービーズの標準化されたプロファイルを示しています。これらのビーズは、フローサイトメーターによ?...

ディスカッション

癌の診断および治療におけるポルフィリンの多くの用途にもかかわらず2、初代ヒト組織における癌性細胞集団と非癌細胞集団を同定するためのフローサイトメトリー試薬としてのポルフィリンの使用の可能性に関する文献は限られています24、25、26。ヒト喀痰のフローサイトメトリー?...

開示事項

すべての著者はバイオアフィニティテクノロジーズの従業員です。

謝辞

フィギュアの準備を支援してくれたDavid Rodriguezと、Navios EXフローサイトメーターの使用についてプレシジョンパソロジーサービス(テキサス州サンアントニオ)に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

参考文献

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