フローサイトメトリーの補正コントロールとして使用するポルフィリン修飾ビーズ

要約

このプロトコルでは、アミン官能化ポリスチレンビーズとポルフィリンTCPPおよびアミドカップリング試薬EDCとの反応によって、フローサイトメトリー用のポルフィリンベースの補償ビーズがどのように調製されるかについて説明しています。ろ過手順は、粒子状の副産物を減らすために使用されます。

要約

フローサイトメトリーは、蛍光測定に基づいて多様な細胞集団を迅速に特性評価および定量することができます。細胞はまず1つ以上の蛍光試薬で染色され、それぞれが異なる蛍光分子(蛍光色素)で機能化され、細胞表面抗原発現などの表現型特性に基づいて細胞に選択的に結合します。細胞に結合した各試薬からの蛍光強度は、指定された範囲の波長を検出するチャネルを使用してフローサイトメーターで測定できます。複数の蛍光色素を使用する場合、個々の蛍光色素からの光が望ましくない検出チャンネルにこぼれることが多く、補正と呼ばれるプロセスで蛍光強度データを補正する必要があります。

補償対照粒子(通常は単一の蛍光色素に結合したポリマービーズ)は、細胞標識実験で使用される各蛍光色素に必要です。フローサイトメーターからの補償粒子からのデータは、蛍光強度測定に補正を適用するために使用されます。このプロトコルでは、蛍光試薬メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン(TCPP)で共有結合的に官能基化されたポリスチレン補正ビーズの調製と精製、およびフローサイトメトリー補正への応用について説明します。本研究では,アミン官能化ポリスチレンビーズをTCPPとアミドカップリング試薬EDC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)でpH 6,室温で16時間撹拌しながら処理した。TCPPビーズを遠心分離により単離し、保存のためにpH7緩衝液に再懸濁した。TCPP関連の微粒子が副産物として観察された。これらの微粒子の数は、オプションのろ過プロトコルを使用して減らすことができます。得られたTCPPビーズは、複数の蛍光色素で標識されたヒト喀痰細胞を用いた実験において、補正のためにフローサイトメーターでうまく使用されました。TCPPビーズは、冷蔵庫で300日間保存した後、安定であることが証明されました。

概要

ポルフィリンは、その蛍光特性と腫瘍標的特性により、生物医学分野で長年にわたって関心を集めてきました^1,2,3。光線力学療法(PDT)およびソノダイナミック療法(SDT)などの治療用途は、癌患者へのポルフィリンの全身投与、腫瘍における薬物の蓄積、および特定の波長のレーザー光または超音波への腫瘍の局所的曝露を伴う。レーザー光または超音波への曝露は、ポルフィリンによる活性酸素種の生成とそれに続く細胞死につながります^4,5。光線力学的診断(PDD)では、ポルフィリン蛍光を使用して癌細胞と正常細胞を区別します⁶。これに関連して、プロトポルフィリンIXは、その前駆体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の全身または局所注射時に腫瘍に蓄積する天然の蛍光ポルフィリンであり、消化管間質腫瘍、膀胱癌、および脳腫瘍を特定するために使用されます^7,8。最近では、多発性骨髄腫における最小限の残存病変を検出するためのアプローチとして5-ALA治療が検討された^....

プロトコル

すべての手順は、適切な個人用保護具を使用して行う必要があります。

1. TCPP原液の調製 1.0 mg/mL

注:これは毎月準備できます。

1. 分析天びん、へら、および計量紙を使用して、49.0〜50.9 mgのTCPPを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。測定された量のTCPPを光から保護しておきます。
   注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。
2. ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から精製水とイソプロパノール(IPA)の必要量を決定します。精製水とイソプロパノールを100 mLのガラスビーカーに加え、蒸発から保護するためにパラフィルムで覆います。
3. ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から重炭酸ナトリウムの必要量を決定します。
4. 分析天びん、ヘラ、および計量紙を使用して、ステップ1.3で決定した必要量の重炭酸ナトリウムを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。
   注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。
5. 精製水とイソプロパノールを含む100mLビーカーに重炭酸ナトリウムを加えます。蒸発から保護す....

結果

ビーズのTCPPラベリングのためのこのプロトコルは、比較的高速で効率的です。図1は、フローサイトメトリーによって決定されたTCPPビーズ標識プロセスの代表的な結果を示す。図1Aは、TCPPを検出するための適切なチャネルで検出されたレインボービーズの標準化されたプロファイルを示しています。これらのビーズは、フローサイトメーターによ?.......

ディスカッション

癌の診断および治療におけるポルフィリンの多くの用途にもかかわらず²、初代ヒト組織における癌性細胞集団と非癌細胞集団を同定するためのフローサイトメトリー試薬としてのポルフィリンの使用の可能性に関する文献は限られています²⁴、^25、26。ヒト喀痰^のフローサイトメトリー?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365