Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri

Flowcytometri kan raskt karakterisere og kvantifisere ulike cellepopulasjoner basert på fluorescensmålinger. Cellene blir først farget med en eller flere fluorescerende reagenser, hver funksjonalisert med et annet fluorescerende molekyl (fluorofor) som binder seg til celler selektivt basert på deres fenotypiske egenskaper, for eksempel celleoverflateantigenuttrykk. Intensiteten av fluorescens fra hvert reagens bundet til celler kan måles på flowcytometeret ved hjelp av kanaler som oppdager et spesifisert bølgelengdeområde. Når flere fluoroforer brukes, søler lyset fra individuelle fluoroforer ofte over i uønskede deteksjonskanaler, noe som krever en korreksjon av fluorescensintensitetsdataene i en prosess som kalles kompensasjon.

Kompensasjonskontrollpartikler, vanligvis polymerperler bundet til en enkelt fluorofor, er nødvendig for hver fluorofor som brukes i et cellemerkingseksperiment. Data fra kompensasjonspartikler fra flowcytometeret brukes til å korrigere fluorescensintensitetsmålingene. Denne protokollen beskriver fremstilling og rensing av polystyrenkompensasjonsperler kovalent funksjonalisert med det fluorescerende reagenset meso-tetra (4-karboksyphenyl) porfin (TCPP) og deres anvendelse i flowcytometrikompensasjon. I dette arbeidet ble aminfunksjonaliserte polystyrenperler behandlet med TCPP og amidkoblingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) ved pH 6 og ved romtemperatur i 16 timer med omrøring. TCPP-kulene ble isolert ved sentrifugering og resuspendert i en pH 7-buffer for lagring. TCPP-relaterte partikler ble observert som biprodukt. Antallet av disse partiklene kan reduseres ved hjelp av en valgfri filtreringsprotokoll. De resulterende TCPP-perlene ble vellykket brukt på et flowcytometer for kompensasjon i eksperimenter med humane sputumceller merket med flere fluoroforer. TCPP-kulene viste seg å være stabile etter lagring i kjøleskap i 300 dager.