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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O protocolo descreve como esferas de compensação à base de porfirina para citometria de fluxo são preparadas pela reação de esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com a porfirina TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC. Um procedimento de filtração é usado para reduzir os subprodutos particulados.

Abstract

A citometria de fluxo pode caracterizar e quantificar rapidamente diversas populações celulares com base em medidas de fluorescência. As células são primeiramente coradas com um ou mais reagentes fluorescentes, cada um funcionalizado com uma molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se liga às células seletivamente com base em suas características fenotípicas, como a expressão de antígenos de superfície celular. A intensidade de fluorescência de cada reagente ligado às células pode ser medida no citômetro de fluxo usando canais que detectam uma faixa especificada de comprimentos de onda. Quando múltiplos fluoróforos são usados, a luz de fluoróforos individuais geralmente transborda para canais de detecção indesejados, o que requer uma correção nos dados de intensidade de fluorescência em um processo chamado compensação.

Partículas de controle de compensação, tipicamente esferas de polímero ligadas a um único fluoróforo, são necessárias para cada fluoróforo usado em um experimento de marcação celular. Os dados das partículas de compensação do citômetro de fluxo são usados para aplicar uma correção nas medidas de intensidade de fluorescência. Este protocolo descreve a preparação e purificação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas covalentemente com o reagente fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) e sua aplicação na compensação por citometria de fluxo. Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) em pH 6 e à temperatura ambiente por 16 h com agitação. As esferas de TCPP foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em tampão pH 7 para armazenamento. Partículas relacionadas ao TCPP foram observadas como subproduto. O número dessas partículas poderia ser reduzido usando um protocolo de filtração opcional. As esferas TCPP resultantes foram usadas com sucesso em um citômetro de fluxo para compensação em experimentos com células de escarro humano marcadas com múltiplos fluoróforos. As esferas de TCPP mostraram-se estáveis após armazenamento em geladeira por 300 dias.

Introduction

As porfirinas têm sido de interesse há muitos anos na área biomédica devido às suas propriedades fluorescentes e de direcionamento tumoral 1,2,3. Aplicações terapêuticas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia sonodinâmica (TSD) envolvem a administração sistêmica de uma porfirina a um paciente com câncer, o acúmulo da droga no tumor e a exposição localizada do tumor a uma luz laser de um comprimento de onda específico ou ultrassom. A exposição à luz laser ou ao ultrassom leva à geração de espécies reativas de oxigênio pela porfirina e subsequente morte celular

Protocol

Todos os procedimentos precisam ser feitos com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Preparo da solução-estoque de TCPP, 1,0 mg/mL

NOTA: Isso pode ser preparado mensalmente.

  1. Usando uma balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar 49,0-50,9 mg de TCPP. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama. Separe a quantidade medida de TCPP protegida da luz.
    Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é ins.......

Representative Results

Este protocolo para a marcação TCPP de contas é relativamente rápido e eficiente. A Figura 1 mostra um resultado representativo do processo de marcação de esferas TCPP determinado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra o perfil padronizado das contas Rainbow, conforme detectado no canal apropriado para detecção de TCPP. Essas esferas servem como um QC para a padronização das tensões do laser para a detecção de TCPP pelo citômetro de fluxo.

Discussion

Apesar das inúmeras aplicações das porfirinas no diagnóstico e terapêutica docâncer2, há pouca literatura sobre seu potencial uso como reagente de citometria de fluxo para a identificação de populações de células cancerosas versus não cancerosas em tecidos humanos primários24,25,26. Nossa pesquisa na análise por citometria de fluxo do escarro humano24,27

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a David Rodriguez pela assistência com a preparação da figura e Serviços de Patologia de Precisão (San Antonio, TX) pelo uso de seu citômetro de fluxo Navios EX.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S.

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