Perlas modificadas con porfirina para uso como controles de compensación en citometría de flujo

La citometría de flujo puede caracterizar y cuantificar rápidamente diversas poblaciones celulares basadas en mediciones de fluorescencia. Las células se tiñen primero con uno o más reactivos fluorescentes, cada uno funcionalizado con una molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se une a las células selectivamente en función de sus características fenotípicas, como la expresión de antígenos de superficie celular. La intensidad de la fluorescencia de cada reactivo unido a las células se puede medir en el citómetro de flujo utilizando canales que detectan un rango específico de longitudes de onda. Cuando se utilizan múltiples fluoróforos, la luz de fluoróforos individuales a menudo se derrama en canales de detección no deseados, lo que requiere una corrección de los datos de intensidad de fluorescencia en un proceso llamado compensación.

Las partículas de control de compensación, típicamente perlas de polímero unidas a un solo fluoróforo, son necesarias para cada fluoróforo utilizado en un experimento de etiquetado celular. Los datos de las partículas de compensación del citómetro de flujo se utilizan para aplicar una corrección a las mediciones de intensidad de fluorescencia. Este protocolo describe la preparación y purificación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas covalentemente con el reactivo fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) y su aplicación en compensación por citometría de flujo. En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) a pH 6 y a temperatura ambiente durante 16 h con agitación. Las perlas TCPP se aislaron por centrifugación y se resuspendieron en un tampón de pH 7 para su almacenamiento. Las partículas relacionadas con TCPP se observaron como un subproducto. El número de estas partículas podría reducirse utilizando un protocolo de filtración opcional. Las perlas TCPP resultantes se utilizaron con éxito en un citómetro de flujo para la compensación en experimentos con células de esputo humano marcadas con múltiples fluoróforos. Las perlas TCPP demostraron ser estables después del almacenamiento en un refrigerador durante 300 días.