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En este artículo

Resumen

El protocolo describe cómo se preparan las perlas de compensación basadas en porfirina para la citometría de flujo mediante la reacción de perlas de poliestireno funcionalizadas con amina con la porfirina TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC. Se utiliza un procedimiento de filtración para reducir los subproductos de partículas.

Resumen

La citometría de flujo puede caracterizar y cuantificar rápidamente diversas poblaciones celulares basadas en mediciones de fluorescencia. Las células se tiñen primero con uno o más reactivos fluorescentes, cada uno funcionalizado con una molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se une a las células selectivamente en función de sus características fenotípicas, como la expresión de antígenos de superficie celular. La intensidad de la fluorescencia de cada reactivo unido a las células se puede medir en el citómetro de flujo utilizando canales que detectan un rango específico de longitudes de onda. Cuando se utilizan múltiples fluoróforos, la luz de fluoróforos individuales a menudo se derrama en canales de detección no deseados, lo que requiere una corrección de los datos de intensidad de fluorescencia en un proceso llamado compensación.

Las partículas de control de compensación, típicamente perlas de polímero unidas a un solo fluoróforo, son necesarias para cada fluoróforo utilizado en un experimento de etiquetado celular. Los datos de las partículas de compensación del citómetro de flujo se utilizan para aplicar una corrección a las mediciones de intensidad de fluorescencia. Este protocolo describe la preparación y purificación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas covalentemente con el reactivo fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) y su aplicación en compensación por citometría de flujo. En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) a pH 6 y a temperatura ambiente durante 16 h con agitación. Las perlas TCPP se aislaron por centrifugación y se resuspendieron en un tampón de pH 7 para su almacenamiento. Las partículas relacionadas con TCPP se observaron como un subproducto. El número de estas partículas podría reducirse utilizando un protocolo de filtración opcional. Las perlas TCPP resultantes se utilizaron con éxito en un citómetro de flujo para la compensación en experimentos con células de esputo humano marcadas con múltiples fluoróforos. Las perlas TCPP demostraron ser estables después del almacenamiento en un refrigerador durante 300 días.

Introducción

Las porfirinas han sido de interés durante muchos años en el campo biomédico debido a sus propiedades fluorescentes y dirigidas a tumores 1,2,3. Las aplicaciones terapéuticas como la terapia fotodinámica (TFD) y la terapia sonodinámica (SDT) implican la administración sistémica de una porfirina a un paciente con cáncer, la acumulación del fármaco en el tumor y la exposición localizada del tumor a una luz láser de una longitud de onda específica o ultrasonido. La exposición a la luz láser o ultrasonido conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno por la porfirina y la posterior muerte celular 4,5. En el diagnóstico fotodinámico (PDD), la fluorescencia de porfirina se utiliza para distinguir las células cancerosas de las células normales6. En este contexto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente natural que se acumula en los tumores tras la inyección sistémica o local de su precursor, el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), se utiliza para identificar tumores del estroma gastrointestinal, cáncer de vejiga y cáncer cerebral 7,8. Más recientemente, se exploró el tratamiento con 5-ALA como un enfoque para detectar la enfermedad residual mínima en el mieloma múltiple9. Nuestro laboratorio ha estado utilizando la tetraarilo porfirina TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por su capacidad para teñir selectivamente células de cáncer de pulmón y células asociadas al cáncer en muestras de esputo humano, que es una propiedad que ha sido explotada en ensayos diagnósticos basados en portaobjetos y citométricos de flujo10.

Algunas porfirinas son bifuncionales en el sentido de que pueden ser utilizadas como agentes terapéuticos y diagnósticos 2,11. En la investigación biomédica, tales porfirinas bifuncionales se utilizan para evaluar cómo su capacidad para atacar selectivamente y matar las células cancerosas es una función de su estructura, así como la forma en que se ve afectada por la presencia de otros compuestos 12,13,14,15,16. Tanto la absorción celular de porfirinas como su citotoxicidad se pueden medir en una plataforma citométrica de flujo de una manera de alto rendimiento. Los espectros de absorción y emisión de las porfirinas fluorescentes son complejos, pero la mayoría de las plataformas citométricas de flujo están equipadas para identificarlas correctamente. El espectro de absorción de las porfirinas fluorescentes se caracteriza por una fuerte banda de absorción en el rango de 380-500 nm, conocida como la banda de Soret. De dos a cuatro bandas de absorción más débiles se observan generalmente en el rango de 500-750 nm (bandas Q)17. Un láser azul de 488 nm, presente en la mayoría de los citómetros de flujo, o un láser violeta (405 nm) pueden generar luz de la longitud de onda apropiada para excitar las porfirinas. Los espectros de emisión de las porfirinas suelen mostrar picos en el rango de 600-800 nm18, lo que resulta en muy poca superposición espectral con fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína o ficoeritrina (PE), pero una superposición considerable con otros fluoróforos de uso frecuente, como la aloficocianina (APC), así como fluoróforos en tándem, como PE-Cy5 y otros. Por lo tanto, cuando se usan porfirinas en ensayos de citometría de flujo multicolor, los controles de fluoróforo único son esenciales para corregir adecuadamente el derrame de fluorescencia en canales distintos del designado para medir la fluorescencia de la porfirina.

Idealmente, los controles de fluoróforo único utilizados para calcular la matriz de derrame para un panel de fluoróforos (también llamados "controles de compensación") deberían consistir en el mismo tipo de célula que la muestra. Sin embargo, el uso de la muestra para este propósito no es óptimo si hay muy poca muestra para empezar o si la población objetivo dentro de la muestra es muy pequeña (por ejemplo, si se quiere observar la enfermedad residual mínima o las células cancerosas en las primeras etapas de la enfermedad). Una alternativa útil a las células son las perlas acopladas con el mismo fluoróforo que se utiliza para analizar la muestra. Muchas de estas cuentas están disponibles comercialmente; Estas perlas están premarcadas con el fluoróforo deseado (perlas específicas de fluoróforos preetiquetadas)19,20, o se les puede unir un anticuerpo marcado con fluorescencia (perlas de captura de anticuerpos)20,21. Si bien las perlas de compensación comerciales están disponibles para muchos fluoróforos, tales perlas no están disponibles para las porfirinas, a pesar de su creciente uso en la investigación básica y clínica.

Además de la preservación de la muestra y las poblaciones positivas versus negativas de tamaño adecuado, las otras ventajas de usar perlas como controles de compensación son la facilidad de preparación, la baja fluorescencia de fondo y la excelente estabilidad en el tiempo22. La desventaja potencial de usar perlas como control de compensación es que el espectro de emisión del anticuerpo fluorescente capturado en las perlas puede diferir del del mismo anticuerpo utilizado para etiquetar las células. Esto puede ser de importancia específica cuando se utiliza un citómetro de flujo espectral20. Por lo tanto, el desarrollo de perlas como control de compensación debe realizarse en el citómetro de flujo que se utilizará para el ensayo para el que se desarrollan las perlas. Además, el desarrollo de las perlas debe incluir una comparación con las células marcadas con el mismo reactivo de tinción fluorescente.

Aquí, describimos la preparación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas con amina TCPP, cuya intensidad de fluorescencia mediana en el canal de detección fue comparable a la de las células marcadas con TCPP en esputo, y su uso como controles de compensación para la citometría de flujo. La autofluorescencia de perlas equivalentes no funcionalizadas fue lo suficientemente baja para su uso como controles de compensación de fluorescencia negativa. Además, estas perlas demostraron estabilidad en el almacenamiento durante casi 1 año.

Protocolo

Todos los procedimientos deben realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación de la solución madre TCPP, 1,0 mg/ml

NOTA: Esto se puede preparar mensualmente.

  1. Usando una balanza analítica, espátula y papel de pesaje, pesa 49.0-50.9 mg de TCPP. Redondee el peso a 1/10 de miligramo. Establezca la cantidad medida de TCPP protegida de la luz.
    NOTA: Use una pistola estática si la lectura de peso es inestable.
  2. Determine las cantidades requeridas de agua purificada e isopropanol (IPA) de la Tabla 1 en función de la cantidad de TCPP pesada en el paso 1.1 . Agregue el agua purificada y el isopropanol a un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml y cubra con parafilm para protegerlo de la evaporación.
  3. Determine la cantidad requerida de bicarbonato de sodio de la Tabla 1 en función de la cantidad de TCPP pesada en el paso 1.1 .
  4. Con la balanza analítica, la espátula y el papel de pesaje, pesar la cantidad necesaria de bicarbonato de sodio determinada en el paso 1.3. Redondee el peso a 1/10 de miligramo.
    NOTA: Use una pistola estática si la lectura de peso es inestable.
  5. Agregue el bicarbonato de sodio al vaso de precipitados de 100 ml que contiene agua purificada e isopropanol. Cubra la solución con parafilm para protegerla de la evaporación.
  6. Coloque la solución del paso 1.5 en una placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva (aprox. 10 min)
  7. Mida el pH para asegurarse de que la solución que contiene bicarbonato de sodio del paso 1.6 tiene un pH entre 9 y 10.
  8. Agregue lentamente el TCPP pesado en el paso 1.1 a la solución del paso 1.7, y continúe agitando hasta que se disuelva (~ 30 min). Protéjase de la luz durante este paso.
  9. Almacenar en un recipiente de vidrio o polipropileno a temperatura ambiente y protegido de la luz.

2. Preparación de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES) y solución tampón de sal hemisódica, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampón MES")

NOTA: Debe prepararse el día de su uso y mantenerse a temperatura ambiente.

  1. Pesar 2,50 g de sal hemisódica MES y añadirla a una botella de plástico de 150 ml.
  2. Agregue 121 ml de agua purificada y disuelva agitando manualmente hasta que no se vea ningún sólido.
  3. Mida el pH del tampón MES para asegurarse de que esté entre 6 y 6.2.
  4. Mantener a temperatura ambiente para su uso el mismo día.

3. N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) polvo

  1. Saque el polvo EDC del congelador y déjelo reposar a temperatura ambiente hasta que lo use en el paso 5.

4. Combinación de perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas con solución TCPP

  1. Añadir 4,3 ml de la solución tampón MES 0,1 M preparada en la etapa 2 a un tubo de polipropileno de 15 ml.
  2. Vortex la suspensión de perlas de poliestireno funcionalizado con aminas (10 μm, 2,5% p/v) durante 60 s a velocidad máxima.
  3. Añadir 288 μL de esta suspensión de perlas recién vortexed al tampón MES del paso 4.1.
  4. Vortex la solución MES/bead durante 15 s a velocidad máxima.
  5. Vortex la solución TCPP de 1 mg/ml preparada en el paso 1 durante 60 s a velocidad máxima.
  6. Agregue 1,20 ml de esta solución madre TCPP recién vorteada a la suspensión MES/talón del paso 4.4.
  7. Vortex la suspensión MES/bead/TCPP durante 15 s a velocidad máxima.
  8. Cubra el tubo con papel de aluminio mientras se prepara la solución EDC.

5. Preparación de la solución madre de hidrocloruro (HCl) de N-(3-dimetlyaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC)

NOTA: La solución EDC es perecedera y debe usarse inmediatamente después de la preparación.

  1. Agregue 20.0 ml de agua purificada a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  2. Pesar 200 mg de EDC HCl del paso 3 y añadirlo al agua (paso 5.1).
  3. Vórtice el EDC HCL durante 15 s a velocidad máxima para generar una solución clara.

6. Preparación de la solución de trabajo EDC HCl/MES

NOTA: La solución EDC HCl/MES es perecedera y debe usarse inmediatamente después de la preparación.

  1. Agregue 54.0 ml de solución tampón MES (preparada en el paso 2) a una botella de plástico de 150 ml.
  2. Añadir 6,0 ml de la solución madre de EDC HCl (preparada en el paso 5) a la solución tampón MES y mezclar agitando durante 10 s.

7. Etiquetado de las perlas con TCPP

  1. Añadir 4,5 ml de solución de trabajo EDC (a partir del paso 6) al tubo de polipropileno de 15 ml que contiene las perlas y el TCPP en el tampón MES (paso 4.7).
  2. Coloque el tubo en un rotador inversor a 35 rpm durante 16 h a temperatura ambiente y protegido de la luz.
  3. Centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 10 min a 1.000 × g.
  4. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 0,8 ml de solución salina balanceada (HBSS) de Hanks.
  5. Transfiera la solución de perlas a un vial de polipropileno ámbar con una pipeta de 1 ml y guárdela a 4 °C hasta que vuelva a usarla.
    NOTA: Las perlas son estables durante al menos 3 meses en este punto.

8. Control de calidad (QC) de las perlas TCPP por citometría de flujo

NOTA: El control de calidad debe centrarse en si la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las perlas TCPP es lo suficientemente brillante para su uso previsto y la cantidad de partículas generadas por el procedimiento. Consulte la sección de resultados representativos para obtener más detalles.

  1. Etiquete un tubo de poliestireno de 5 ml como "perlas TCPP negativas".
    NOTA: Las perlas negativas son diferentes de las perlas funcionalizadas con amina utilizadas para el etiquetado. Vea la tabla de materiales.
  2. Etiquete otro tubo como "perlas positivas TCPP".
  3. Etiquete otro tubo como "cuentas de arco iris".
  4. Alícuota 300 μL de HBSS helado en los tubos etiquetados con "perlas TCPP negativas" y "perlas TCPP positivas".
  5. Agregue 500 μL de HBSS helado en el tubo etiquetado como "Cuentas de arco iris".
  6. Vortex la suspensión de perlas de poliestireno no funcionalizado (sin etiquetar) brevemente a velocidad máxima (2-3 s) y agregue 10 μL de ella al tubo etiquetado como "perlas negativas TCPP".
  7. Vortex la suspensión de perlas etiquetadas con TCPP (finalizada en el paso 7.5) brevemente a velocidad máxima, y agregue 3 μL de ella al tubo de "perlas positivas TCPP".
  8. Vortex la suspensión de cuentas Rainbow brevemente a velocidad máxima y agregue dos gotas de ella en el tubo "Rainbow beads".
  9. Mantenga todos los tubos sobre hielo, cubiertos y protegidos de la luz.
  10. Inicie los procedimientos de inicio diarios apropiados del citómetro de flujo y realice un control de calidad para verificar los fluidos óptimos y la alineación del láser.
    NOTA: Para esta parte del protocolo, se supone que el operador está capacitado en el uso del citómetro de flujo disponible, incluidos los procedimientos de estandarización de la dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, así como los principios básicos para calcular la matriz de compensación correcta.
  11. Ejecute las cuentas Rainbow y las cuentas TCPP sin cambiar la configuración de voltaje entre las diferentes ejecuciones.
    1. Corre y recoge 10.000 eventos de las cuentas del arco iris.
    2. Realice un enjuague con agua y recopile 10,000 eventos de las perlas negativas de TCPP.
    3. Realice un enjuague con agua y recoja 10,000 eventos de las perlas positivas para TCPP.
    4. Realice un enjuague con agua de 1 minuto.
      NOTA: Es importante realizar un enjuague con agua después de ejecutar las perlas TCPP. Si el TCPP no se enjuaga de las líneas en el citómetro, existe la posibilidad de que el TCPP residual pueda marcar las células en el siguiente tubo a adquirir.
    5. Realice los protocolos de limpieza y apagado apropiados específicos según las instrucciones del fabricante para el citómetro.
      NOTA: Para obtener resultados representativos, consulte la figura 1.

9. Filtración de cuentas

NOTA: Si el control de calidad de las perlas por citometría de flujo (paso 8) muestra una alta proporción de partículas (70% o más), considere filtrar la suspensión del cordón utilizando el protocolo a continuación (Figura 2).

  1. Agregue 3.20 ml de HBSS helado a 0.8 ml de la suspensión de perlas TCPP finalizada en el paso 7.5 (creando una dilución quíntuple).
  2. Vortex la suspensión de talón diluido a velocidad máxima durante 15 s.
  3. Retire el émbolo de una jeringa desechable de 5 ml.
  4. Ajuste la jeringa con un filtro de punta de fibra de vidrio (5 μm, 13 mm de diámetro).
  5. Agregue 4 ml de HBSS a la jeringa.
  6. Añadir 0,5 ml de la suspensión de perlas diluidas de vórtice (paso 9.2).
  7. Utilice el émbolo para filtrar la suspensión a través de la configuración de la jeringa/filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  8. Lave las perlas extrayendo 5 ml de HBSS fresco en la jeringa a través del filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  9. Empuje el HBSS de nuevo en el contenedor de residuos a aproximadamente 2 gotas/s.
  10. Para retirar las perlas del filtro, extraiga otros 5 ml de HBSS fresco en la jeringa a través del filtro.
  11. Retire con cuidado el filtro de la jeringa.
  12. Expulse la suspensión del talón de la jeringa en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
  13. Vuelva a colocar el filtro en la jeringa y repita los pasos 9.10-9.12 cuatro veces más. Luego deseche el filtro y la jeringa.
  14. Repita los pasos 9.2-9.13 hasta que se hayan filtrado todas las cuentas del paso 9.1. Use una jeringa nueva y filtre cada vez.
  15. Centrifugar las suspensiones de perlas filtradas durante 10 min a 1.000 × g a temperatura ambiente.
  16. Aspirar el sobrenadante de cada tubo de 50 ml y resuspender suavemente las perlas, combinándolas en 0,5 ml de HBSS fresco.
  17. Transfiera las perlas con una micropipeta de p1.000 a un vial nuevo de ámbar, vidrio o polipropileno y guárdelas a 4 °C.
  18. Repita el paso 8 para determinar si la proporción de partículas relacionadas con TCPP en la suspensión de perlas filtradas ha disminuido. Para obtener resultados representativos, consulte la figura 3.

Resultados

Este protocolo para el etiquetado TCPP de perlas es relativamente rápido y eficiente. La Figura 1 muestra un resultado representativo del proceso de etiquetado de perlas TCPP determinado por citometría de flujo. La Figura 1A muestra el perfil estandarizado de las cuentas Rainbow, tal como se detecta en el canal apropiado para detectar TCPP. Estas perlas sirven como un control de calidad para la estandarización de los voltajes láser para la detección de TCPP...

Discusión

A pesar de las muchas aplicaciones de las porfirinas en el diagnóstico y la terapéutica del cáncer2, existe una literatura limitada sobre su uso potencial como reactivo citométrico de flujo para la identificación de poblaciones celulares cancerosas versus no cancerosas en tejidos humanos primarios24,25,26. Nuestra investigación sobre el análisis citométrico de flujo del esputo humano

Divulgaciones

Todos los autores son empleados de bioAffinity Technologies.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de figuras y Precision Pathology Services (San Antonio, TX) por el uso de su citómetro de flujo Navios EX.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

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