Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri

Flödescytometri kan snabbt karakterisera och kvantifiera olika cellpopulationer baserat på fluorescensmätningar. Cellerna färgas först med ett eller flera fluorescerande reagens, var och en funktionaliserad med en annan fluorescerande molekyl (fluorofor) som binder till celler selektivt baserat på deras fenotypiska egenskaper, såsom cellytans antigenuttryck. Intensiteten av fluorescens från varje reagens bundet till celler kan mätas på flödescytometern med hjälp av kanaler som detekterar ett specificerat våglängdsområde. När flera fluoroforer används spiller ljuset från enskilda fluoroforer ofta över till oönskade detektionskanaler, vilket kräver en korrigering av fluorescensintensitetsdata i en process som kallas kompensation.

Kompensationskontrollpartiklar, vanligtvis polymerpärlor bundna till en enda fluorofor, behövs för varje fluorofor som används i ett cellmärkningsexperiment. Data från kompensationspartiklar från flödescytometern används för att tillämpa en korrigering på fluorescensintensitetsmätningarna. Detta protokoll beskriver beredning och rening av polystyrenkompensationspärlor kovalent funktionaliserade med det fluorescerande reagenset mesotetra (4-karboxifenyl) porfin (TCPP) och deras tillämpning i flödescytometrikompensation. I detta arbete behandlades aminfunktionaliserade polystyrenpärlor med TCPP och amidkopplingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) vid pH 6 och vid rumstemperatur i 16 timmar med omrörning. TCPP-pärlorna isolerades genom centrifugering och återsuspenderades i en pH 7-buffert för lagring. TCPP-relaterade partiklar observerades som en biprodukt. Antalet av dessa partiklar kan minskas med hjälp av ett valfritt filtreringsprotokoll. De resulterande TCPP-pärlorna användes framgångsrikt på en flödescytometer för kompensation i experiment med humana sputumceller märkta med flera fluoroforer. TCPP-pärlorna visade sig vara stabila efter förvaring i kylskåp i 300 dagar.