Хронические раны, устойчивые к антибиотикам, представляют серьезную угрозу для системы здравоохранения. Инфекции биопленки являются упорными и враждебными и могут привести к недостаточному функциональному закрытию раны. Мы представляем клинически значимую модель хронических ран, инфицированных биопленкой, по всей толщине. Эта модель эффективна как для механистических исследований, так и для тестирования вмешательств.
Инфицирование биопленкой является основным фактором, способствующим хронизации раны. Установление клинически значимой экспериментальной раневой биопленочной инфекции требует участия иммунной системы хозяина. Итеративные изменения в организме хозяина и возбудителя при образовании такой клинически значимой биопленки могут происходить только in vivo. Модель свиной раны получила признание за свои преимущества в качестве мощной доклинической модели. Существует несколько подходов к изучению раневых биопленок. Системы in vitro и ex vivo имеют дефицит с точки зрения иммунного ответа хозяина. Краткосрочные исследования in vivo включают острые реакции и, таким образом, не допускают созревания биопленки, как это обычно происходит клинически. Первое долгосрочное исследование биопленки ран свиней было проведено в 2014 году. В исследовании было признано, что раны, инфицированные биопленкой, могут закрываться, как определено с помощью планиметрии, но барьерная функция кожи пораженного участка может не восстановиться. Позже это наблюдение было подтверждено клинически. Так родилась концепция функционального закрытия раны. Закрытые раны, но с недостаточной барьерной функцией кожи, могут рассматриваться как невидимые раны. В данной работе мы стремимся сообщить методологические детали, необходимые для воспроизведения долгосрочной модели тяжелой ожоговой травмы, инфицированной биопленкой, на свиньях, которая является клинически значимой и имеет трансляционную ценность. Этот протокол содержит подробные рекомендации по установлению 8-недельной инфекции раневой биопленки с использованием P. aeruginosa (PA01). Восемь ожоговых ран полной толщины были созданы симметрично на тыльной стороне домашних белых свиней, которые были инокулированы (PA01) на 3-е сутки после ожога; Впоследствии была проведена неинвазивная оценка заживления раны в разные моменты времени с использованием лазерной спекл-визуализации (LSI), ультразвука высокого разрешения (HUSD) и трансэпидермальной потери воды (TEWL). Привитые ожоговые раны накладывали четырехслойную повязку. Биопленки, как было установлено и подтверждено структурно с помощью SEM на 7-й день после инокуляции, нарушали функциональное закрытие раны. Такой неблагоприятный исход может быть отменен в ответ на соответствующие вмешательства.
Инфицирование биопленкой осложняет ожоговые и хронические раны и вызывает хронизацию 1,2,3,4,5. В микробиологии в первую очередь изучаются механизмы формирования биопленки, с акцентом на микробы 1,6. Уроки, извлеченные из этих исследований, имеют первостепенное значение с точки зрения биологической науки, но не обязательно могут быть применимы к клинически значимым патогенным биопленкам 6,7,8. Клинически значимые структурные агрегаты биопленки должны включать как микробные, так и принимающие факторы 8,9,10. Такое микроокружение позволяет включать итеративные взаимодействия между хозяином и микробом, которые имеют решающее значение для разработки клинически значимой биопленки 7,8. В таком процессе участие иммунных клеток и факторов, передающихся через кровь, имеет решающее значение11,12. Взаимодействие между хозяином и микробом, лежащее в основе клинических патогенных биопленок, наблюдаемое при хронических ранах, происходит в течение длительного периода времени. Таким образом, любой экспериментальный подход, направленный на разработку трансляционно релевантной модели биопленочной инфекции, должен учитывать эти факторы. Таким образом, мы стремились разработать клинически воспроизводимую модель хронической биопленочной инфекции свиней.
В то время как исследования на людях, несомненно, представляют собой лучший подход к изучению результатов исцеления, часто они не лучшим образом подходят для рассмотрения лежащих в их основе механизмов и новых механистических парадигм. Этические соображения ограничивают использование дизайна исследований, требующих забора нескольких биопсий из хронической раны в разные моменты времени. Поэтому крайне важно иметь хорошо зарекомендовавшую себя и воспроизводимую животную модель, позволяющую проводить инвазивные исследования для тщательного изучения судьбы биопленки 7,13. Выбор модели животного зависит от нескольких факторов, включая научную/трансляционную значимость и логистику. Система свиней широко признана наиболее ценной с точки зрения трансляций экспериментальной моделью для изучения ран кожи человека7. Таким образом, в данной работе сообщается об установленной модели ожоговой травмы, зараженной биопленкой, на свиньях. Данная работа основана на нескольких оригинальных публикациях, опубликованных в литературе 2,7,13,14,15,16,17. В этом исследовании для инфицирования раны был выбран клинический изолят синегнойной палочки с множественной лекарственной устойчивостью (PA01). P. aeruginosa является частой причиной раневых инфекций 2,18,19,20. Это грамотрицательная бактерия, которую трудно лечить из-за ее устойчивости к некоторым антибиотикам11,19,21. Ни одна из моделей биопленки свиней, о которых сообщалось до сих пор, не включала 8-недельные долгосрочные исследования 22,23,24,25,26. Хронические раны – это те, которые остаются открытыми в течение 4 недель и более 14,27,28. В литературе отсутствуют другие модели биопленок хронических ран. В данной работе рассматривается понятие функционального закрытия раны 2,7,13,15,17,29.
Все исследования на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) #21147. Исследование проводилось в Ресурсном центре лабораторных животных (LARC) Университета Индианы. В этом протоколе мы использовали самку домашней белой свиньи (70-80 фунтов).
1. Акклиматизация животных
2. Обустройство операционного зала
3. Седация свиньи
4. Индукция анестезии
5. Подготовка животных к ожоговым ранениям
6. Антисептическая подготовка и разметка места ожога кожи
7. Процедура нанесения ожоговых ран
8. Оценка и визуализация ожоговых ран
9. Бинтование и перевязка
10. Восстановление животных и послеоперационный уход
11. Подготовка и посев биопленки
12. Забор биопсии
13. Эвтаназия и забор тканей
Стандартизированное ожоговое устройство использовалось для создания ожоговых ран на всю толщину при 150 °C в течение 1 мин, что приводило к однородному глубокому ожогу с равномерным краем эритемы и воспаления (рис. 3 и рис. 7). Каждая свинья получила по восемь ожоговых ран на спине, как показано на рисунке 3C.
Неинвазивная оценка ожоговых ран в режиме реального времени с помощью ультразвука высокого разрешения в В-режиме для подтверждения глубины раны и прогрессирования заживления раны с течением времени показала разрушение всех слоев кожи вплоть до подкожно-жировой клетчатки (рис. 4). Лазерная спекл-визуализация (ЛСС) использовалась для дальнейшей характеристики перфузии раны (рис. 4А).
К 7-му дню после инокуляции ожоговые раны показали толстую гнойную оболочку на поверхности раны, что подтвердило инфекцию и образование биопленки ожоговой раны (рис. 7А). Цифровая планиметрия показала увеличение площади раны на 3-е сутки после инокуляции PAO1 из-за воспалительной реакции в месте раны и по краям (рис. 7A,B). Несмотря на то, что площадь раны начала уменьшаться к 14-му дню после инокуляции, на 56-й день наблюдалось неполное заживление примерно до 25% от первоначального размера раны, что указывает на хронический характер ран (рис. 7B). Хронизация раны и нарушение заживления ран были дополнительно подтверждены TEWL, которая показала высокую трансэпидермальную потерю воды. Результаты TEWL отражали потерю барьерной функции кожи по сравнению с нормальной кожей во все измеренные временные точки, что указывает на функциональное нарушение заживления ожоговой раны (рис. 7B). Это также было подтверждено подавлением плотных соединительных белков ZO-1 и 213 и нарушением восстановления барьерной функции кожи, что отразилось в высоких значениях TEWL, наблюдаемых на 35-й день (середина) и 56-й день (поздний), несмотря на визуальное закрытие раны (рис. 7I).
Глубина ожога была дополнительно подтверждена окрашиванием H&E, которое показало деформацию и некроз всех гистологических слоев кожи, как показано на рисунке 7C. Установленная биопленка PA01 была дополнительно валидирована на 7-й день после инокуляции с помощью КОЕ (рис. 7E,F), СЭМ-визуализации (рис. 7G) и иммунофлуоресцентного окрашивания (рис. 7H).
Рисунок 1: Подготовка к процедуре . (A) Подготовка операционного стола. (B) Канюляция ушной вены для внутривенного введения жидкостей и лекарственных препаратов. (C) Термоодеяло для защиты свиньи от переохлаждения во время процедуры. (D) Настройка горелки и таймера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стерилизация и маркировка операционного поля . (А) Стрижка и стерилизация волос. (B) Маркировка места ожога с использованием стерильного стандартного шаблона с восемью ранами (каждая рана имеет размер 2 x 2 дюйма). (C) Окончательная маркировка стерильным маркером для кожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Индукция ожоговой раны. (A,B) Стандартизированная горелка с манометром и автоматическим блоком управления (2 дюйма x 2 дюйма), применяемая к предварительно размеченному месту раны. (C) На всей спине видны восемь ожоговых ран во всю толщину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Неинвазивная визуализация и оценка ожоговых ран. (A) Лазерная спекл-визуализация (LSI) с правильной ориентацией индикатора лазерного луча к центру раны показана на изображении слева; на рисунке справа показан аппарат LSI и карта перфузии кожных сосудов в режиме реального времени. (B) Применение трансэпидермального датчика водопотери (TEWL) к месту раны в пяти различных точках (четыре угла раны и центр, показанный на изображении в правом нижнем углу) показано на изображении слева; Изображение справа представляет собой репрезентативный экран, снятый в режиме реального времени с измерением TEWL. (C) Гармоническое ультразвуковое сканирование ожоговой раны с помощью ультразвукового датчика высокого разрешения 16 МГц показано с левой стороны; На изображении справа показан ультразвуковой аппарат и запись экрана в режиме реального времени. (D) Структурные (B-режимные изображения, УЗИ в оттенках серого) и биомеханические (эластография, цветное ультразвуковое исследование) изображения места ожоговой раны в день прививки и на 7-й день после инокуляции. Глубина раны обозначается желтой пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Перевязка и перевязка раны . (А) Наложение прозрачной пленочной повязки на каждую рану отдельно. (Б) Все дорсальные привитые ожоговые раны покрываются первым слоем повязки. (C) На всю область раны накладывается повязка из прозрачной пленки большего размера. (D) Наложение второго слоя марли и рыхлого слоя эластичного эластичного бинта вокруг всего туловища свиньи, чтобы впитать любой жидкий экссудат, который выходит из ран. (E) Покрытие всей области раны последним слоем из 4 пластырей в лейкопластыре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Бактериальный посев. (A) Подготовка к инокуляции синегнойной палочки (PA01) на 3-й день после ожога. (B) Местное применение посева с помощью пипетки с использованием объема 500 мкл для каждой раны. (C) Посевной материал равномерно распределяется по раневой поверхности с помощью стерильного одноразового разбрасывателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Ход заживления раны и подтверждение биопленки . (A) Репрезентативные изображения закрытия раны в течение всего периода исследования. Масштабная линейка = 1 см. (B) Количественное определение площади раны и измерений TEWL на временной шкале исследования (n = 6). Данные представлены в виде среднего ± SD. N.S. относится к значению TEWL нормальной кожи. (C) Принципиальная схема, показывающая различные участки биопсии раны. Г. Окрашивание H&E с соответствующим трихромным окрашиванием Массона, демонстрирующим искажение и некроз всех слоев кожи на 3-й день после ожога и 7-й день после инокуляции. Масштабная линейка = 500 мкм. (E) Репрезентативные цифровые изображения неселективного агара (агар Лурии-Бертани) и селективного агара (синегнойный изоляционный агар) с колониями бактерий, выращенных из тканей раневого ложа свиньи. Селективная среда позволяет проводить точный подсчет только колоний PA01. (F) Показан расчет колониеобразующей единицы (КОЕ) на основе подсчета колоний, взятого из обработанных биопсий раны после инокуляции на 7-й день. (G) Репрезентативные изображения привитых ожоговых ран методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на 7-й день после инокуляции, на которых видна созданная биопленка PA01 с увеличенным изображением с правой стороны. Масштабная линейка = 1 мкм. Красные стрелки указывают на внеклеточные полимерные вещества (ЭПС). (H) P. aeruginosa на ожоговых ранах визуализировали с помощью антисинегнойных (зеленых) антител; Иммунофлуоресцентные изображения биопсии раны после инокуляции на 7-й день показывают сильную колонизацию тканей раны P. aeruginosa. Масштабная линейка = 100 мкм. (I) Репрезентативная мозаика (масштабная линейка = 200 мкм) и соответствующие увеличенные (масштабная линейка = 50 мкм) изображения окрашенных ZO-1 и ZO-2 срезов на 35-й и 56-й день после инокуляции, демонстрирующие снижение экспрессии белков после индуцированной инфекции. Замороженные срезы (10 мкм), внедренные в ОКТ, окрашивали с использованием анти-ZO-1 (зеленый) или анти-ZO-2 (зеленый). Секции были окрашены с помощью DAPI. Гистограммы показывают количественную оценку интенсивности сигналов ZO-1 и ZO-2. Данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3); * p < 0,05 по сравнению со спонтанными. Для проверки значимости был проведен однофакторный дисперсионный анализ тестов Манна-Уитни или Краскела-Уоллиса. Рисунок 7H, I был изменен по сравнению с Roy et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В настоящем отчете представлен подробный протокол создания свинообразной модели хронической раневой биопленочной инфекции для экспериментальных исследований. Ранее сообщалось о нескольких моделях биопленки свиней 22,23,24,25,26, но ни одна из них не является моделью свиней, включающей 8-недельные долгосрочные исследования. Хронические раны – это те, которые остаются открытыми в течение 4 недель и более 14,27,28. В литературе отсутствуют другие модели биопленок хронических ран. В данной работе рассматривается понятие функционального закрытия раны 2,7,13,15,17,29. Исследование, проведенное в 2014 году, было первым, в котором сообщалось, что раны, инфицированные биопленкой, могут закрываться без восстановления барьернойфункции. В данной работе сообщается об измерении барьерной функции кожи в заживающей ране с помощью трансэпидермальной потери воды (TEWL).
Анатомически и физиологически кожа свиньи, по сравнению с кожей других мелких животных, ближе к коже человека32,33,34. Как кожа свиньи, так и человека имеет толстый эпидермис 33, а соотношение толщины дермы и эпидермиса колеблется от 10:1 до13:1 у свиньи, что сопоставимо с человеком34,35. Гистологически и биомеханически кожа человека и свиньи обнаруживает сходство в гребнях, подкожном жире, дермальном коллагене, распределении волос, структурах придатков, а также размере и распределении кровеносных сосудов36,37,38. Функционально как свиньи, так и люди имеют сходство в составе липидного, белкового и кератинового компонентов эпидермального слоя, а также сопоставимые иммуногистологические картины37,38. Иммунная система свиней, по сравнению с иммунной системой других мелких животных, имеет большее сходство с иммунной системой человека, что означает, что свиньи являются подходящей моделью для исследований взаимодействий с хозяином, которые являются неотъемлемой частью сложности патологической биопленки при раневыхинфекциях. Критическая оценка плюсов и минусов, предложенных различными животными моделями, привела к консенсусу о том, что свиньи представляют собой эффективную модель для изучения заживления ран34,38. Кроме того, у домашних свиней спонтанно развиваются хронические бактериальные инфекции, что наблюдается у людей10. Ожоговое устройство, используемое для создания ран, представляет собой усовершенствованное и автоматизированное ожоговое устройство, которое подает тепловую энергию на основе температуры, считываемой с целевого участка кожи22,40. Такой подход повышает тяжесть и воспроизводимость ожоговой травмы. Использование клинических изолятов бактерий для инфицирования ран свиньи повышает ценность в качестве доклинической модели.
Ожоговые травмы носят сложный характер и вызывают несколько системных нарушений20,41. Таким образом, важно реанимировать свинью достаточным количеством жидкости и не допускать переохлаждения во время анестезии и восстановления. Несколько факторов могут препятствовать заживлению раны, в том числе питание после ожога, жидкость и боль42. Поэтому очень важен тщательный контроль за питанием и оценкой боли. Боль после ожога может быть сильной и влиять на поведение и рацион животного. Необходимо активно рассматривать меры по решению поведенческих проблем. Регулярная и непрерывная оценка боли и ее лечение являются обязательными. В этот протокол включен подробный лист оценки боли с очень подробным планом обезболивания. Чтобы избежать перекрестного загрязнения между ранами, особое внимание следует уделять нанесению первого слоя повязки на каждую рану отдельно. Следует проявлять особую осторожность при обращении со всеми биологически опасными материалами и при проведении тщательной дезинфекции оборудования, инструментов и всего операционного. Наложение нескольких слоев повязки предотвращает обнажение ран свиньей во время попытки растереть или почесать зудящую спину.
Свинья в текущей модели не была скомпрометирована основными метаболическими нарушениями (например, диабетом), и, следовательно, изучаемый эффект был исключительно влиянием бактериальной инфекции биопленки на заживление ран. Тем не менее, модель подходит для индукции диабета (например, с использованием стрептозотоцина) и может быть использована для изучения инфекции биопленки в связи с основным метаболическим расстройством. Другим ограничением модели является контролируемая инфекция с использованием бактерии P. aeruginosa. Ожидается, что нормальная микрофлора кожи свиньи также может расти в ране и влиять на заживление. Необходим дальнейший анализ с использованием NGS или других передовых методов для определения микробного содержимого раны. Нынешняя модель также может быть применена к смешанным инфекциям, вызванным различными видами микробов (например, грибковыми, вирусными и т.д.). Это важный элемент, так как клинически значимые раны, скорее всего, будут заселены смешанными микробами, которые могут по-разному влиять на заживление ран.
У этой модели есть много потенциальных преимуществ, в том числе сходство со сложностью и долгосрочными последствиями хронических ран человека, автоматизированный и воспроизводимый процесс ожога, а также использование клинически изолированных видов бактерий. Использование нескольких неинвазивных методов визуализации представляет собой мощный подход к сбору полезных физиологических данных, характеризующих рану. Наконец, оценка функционального заживления ран путем восстановления барьерной функции кожи на основе TEWL имеет решающее значение. В заключение, в данной работе показан надежный, простой, подробный и удобный в использовании протокол для разработки тяжелой ожоговой травмы, инфицированной биопленкой, с использованием модельной системы свиньи.
Мы хотели бы поблагодарить Ресурсный центр лабораторных животных (LARC) Университета Индианы за поддержку и ветеринарную помощь животным во время исследования. Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения NR015676, NR013898 и DK125835, а также грантом Министерства обороны W81XWH-11-2-0142. Кроме того, эта работа была отмечена следующими наградами Национальных институтов здравоохранения: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 и NS42617.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26x30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4x4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved