Fluorescensbaseret kvantificering af mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer ved hjælp af levende billeddannelse i HeLa-celler

Mitokondrier er dynamiske organeller, der er kritiske for metabolisk homeostase ved at kontrollere energiproduktionen via ATP-syntese. For at understøtte cellulær metabolisme samarbejder forskellige mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer for at opretholde et sundt mitokondrienetværk. En sådan vej er mitofagi, hvor PTEN-induceret kinase 1 (PINK1) og Parkin phospho-ubiquitination af beskadigede mitokondrier letter autofagosomsekvestrering og efterfølgende fjernelse fra cellen via lysosomfusion. Mitofagi er vigtig for cellulær homeostase, og mutationer i Parkin er forbundet med Parkinsons sygdom (PD). På grund af disse resultater har der været en betydelig vægt på at undersøge mitokondrieskader og omsætning for at forstå de molekylære mekanismer og dynamikker i mitokondriel kvalitetskontrol. Her blev levende cellebilleddannelse brugt til at visualisere mitokondrienetværket af HeLa-celler til at kvantificere mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne efter behandling med carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt afkoblingsmiddel. Derudover blev en PD-bundet mutation af Parkin (Parkin^T240R), der hæmmer Parkin-afhængig mitofagi, udtrykt for at bestemme, hvordan mutant ekspression påvirker mitokondrienetværket sammenlignet med celler, der udtrykker vildtype Parkin. Protokollen skitseret her beskriver en simpel arbejdsgang ved hjælp af fluorescensbaserede tilgange til effektivt at kvantificere mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer.