We danken de leden van het Evans-lab voor hun doordachte feedback op dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars en Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.com.

1. Bereiding van biologische monsters
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidskast. Spuit het oppervlak van de kast en alle materialen met 70% ethanol.
<ol><li>HeLa cel kweken en transfectie<ol><li>Kweek 30.000 HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) met 4,5 g / L glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% L-glutamine-oplossing (HeLa-media; zie Tabel met materialen). Plaats ...

Kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus

De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming30. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te ...

Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie1, aangeboren immuniteit2,3 en celsignalering 4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft8. PD is genetisch gekoppeld aan mitofagie, een mitochondriale kwaliteitscontroleroute die nodig is voor het handhaven van cellulaire homeostase die selectief beschadigde mitochondriën verwijdert 9,10. Studies hebben meerdere onafhankelijke mitofagieroutes geïdentificeerd, waaronder het FUN14-domein met 1 (FUNDC1) -gemedieerde mitofagie, Bcl-2 interagerende eiwit 3 (BNIP3) -gefaciliteerde mitofagie, NIX-afhankelijke mitofagie en de goed gekarakteriseerde PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) / Parkin-gereguleerde mitofagie10,11. PINK1 (een vermeend kinase) en Parkin (een E3 ubiquitine ligase) werken samen met fosfo-ubiquitinaat beschadigde mitochondriën, die de vorming van autofagosomen aandrijft die het beschadigde organel overspoelen en fuseren met lysosomen om de afbraak te initiëren 12,13,14,15,16. Mutaties in Parkin zijn in verband gebracht met PD-gebonden fenotypes zoals neurodegeneratie via het verlies van dopaminerge neuronen17,18.
Hier wordt een protocol beschreven waarin HeLa-cellen, routinematig gebruikte onsterfelijke cellen afgeleid van baarmoederhalskanker, worden gebruikt om de rol van Parkin bij het handhaven van mitochondriale netwerkgezondheid te onderzoeken. HeLa-cellen drukken verwaarloosbare niveaus van endogene Parkin uit en vereisen daarom exogene Parkin-expressie19. Om de rol van Parkin in de gezondheid van mitochondriale netwerken te bestuderen, worden HeLa-cellen getransfecteerd met wild-type Parkin (ParkinWT), een Parkin-mutant (ParkinT240R) of een lege controlevector. ParkinT240R is een autosomaal recessieve juveniele parkinsonismemutatie die de Parkin E3-ligaseactiviteit beïnvloedt, waardoor de efficiëntie van de mitofagieroute aanzienlijk wordt verminderd20. HeLa-cellen zijn onderhevig aan milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Behandeling met ernstige concentraties CCCP wordt routinematig gebruikt om parkine-gemedieerde mitofagie te induceren in verschillende cellijnen, zoals HeLa- en COS-7-cellen21,22,23.
Na de behandeling maakt het protocol gebruik van live beeldvorming van het mitochondriale netwerk met behulp van twee momenteel beschikbare mitochondriale gerichte fluorescerende kleurstoffen. Tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE) is een kationische kleurstof die fluoresceert op basis van mitochondriaal membraanpotentiaal24, terwijl MitoSOX een mitochondriale superoxide-indicator is waarbij de fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideconcentratie25. Ten slotte maakt het geschetste protocol gebruik van een op fluorescentie gebaseerde kwantificering en eenvoudige workflow om het mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren met minimale ruimte voor gebruikersbias. Hoewel dit protocol is ontworpen om de mitochondriale functie in HeLa-cellen te bestuderen, kan het worden aangepast voor extra cellijnen en primaire celtypen om de mitochondriale netwerkgezondheid kwantitatief te karakteriseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (ParkinT240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

Auteur in de schijnwerpers: op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriaal membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen  

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

In dit protocol werd op fluorescentie gebaseerde kwantificering gebruikt om de membraanpotentiaal en superoxideniveaus van het mitochondriale netwerk te meten na CCCP-behandeling (figuur 1). Deze workflow gebruikte HeLa-cellen, een vereeuwigde cellijn afgeleid van baarmoederhalskanker. HeLa-cellen worden routinematig gebruikt om mitochondriale biologie te bestuderen en zijn relatief vlak, waardoor het gemakkelijk is om het mitochondriale netwerk te visualiseren met behulp van microscopie. Om...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells at JoVE.com

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Dit onderzoek richt zich op mitochondriale ontregeling bij neurodegeneratieve ziekten. Wij geloven dat dit onderzoek kan worden gebruikt om mogelijke oorzaken voor het begin van de ziekte te begrijpen die kunnen leiden tot therapieën die neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en ALS bestrijden. Technieken zoals superresolutiemicroscopie zoals STED en SIM of expansiemicroscopie hebben het vermogen verbeterd om de eiwitverdeling binnen individuele organellen en mitochondriale distributie door de cel nauwkeurig te begrijpen.Resultaten van deze techniek kunnen worden gebruikt als uitgangspunt om het effect van aan de ziekte van Parkinson gekoppelde mutaties op mitochondriale omzet te bestuderen en het belang te begrijpen van het reguleren van reactieve zuurstofsoortenniveaus en mitochondriaal membraanpotentieel om de neuronale gezondheid te behouden. Ons laboratorium heeft tot doel om individuele mitochondriale kwaliteitscontrolepaden mechanistisch te karakteriseren om het samenspel tussen deze paden te begrijpen. Door inzicht te hebben in de dynamiek van de route, kan men begrijpen hoe mitochondriën worden onderhouden en hoe mitochondriale ontregeling bijdraagt aan het ontstaan van neurodegeneratieve ziekten.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Abstract