Fluorescensbasert kvantifisering av mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer ved bruk av levende avbildning i HeLa-celler

Mitokondrier er dynamiske organeller som er kritiske for metabolsk homeostase ved å kontrollere energiproduksjon via ATP-syntese. For å støtte cellulær metabolisme samarbeider ulike mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer for å opprettholde et sunt mitokondrielt nettverk. En slik vei er mitofagi, hvor PTEN-indusert kinase 1 (PINK1) og Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadede mitokondrier letter autofagosomsekvestrasjon og påfølgende fjerning fra cellen via lysosomfusjon. Mitofagi er viktig for cellulær homeostase, og mutasjoner i Parkin er knyttet til Parkinsons sykdom (PD). På grunn av disse funnene har det vært betydelig vekt på å undersøke mitokondriell skade og omsetning for å forstå molekylære mekanismer og dynamikk i mitokondriell kvalitetskontroll. Her ble levende celleavbildning brukt til å visualisere det mitokondrielle nettverket av HeLa-celler, for å kvantifisere mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivåene etter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt frakoblingsmiddel. I tillegg ble en PD-bundet mutasjon av Parkin (Parkin^T240R) som hemmer Parkin-avhengig mitofagi uttrykt for å bestemme hvordan mutant uttrykk påvirker mitokondrienettverket sammenlignet med celler som uttrykker villtype Parkin. Protokollen som er skissert her, beskriver en enkel arbeidsflyt ved hjelp av fluorescensbaserte tilnærminger for å kvantifisere mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer effektivt.