Fluorescensbaserad kvantifiering av mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med hjälp av levande avbildning i HeLa-celler

Mitokondrier är dynamiska organeller som är kritiska för metabolisk homeostas genom att kontrollera energiproduktionen via ATP-syntes. För att stödja cellulär metabolism samarbetar olika mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att upprätthålla ett hälsosamt mitokondriellt nätverk. En sådan väg är mitofagi, där PTEN-inducerat kinas 1 (PINK1) och Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadade mitokondrier underlättar autofagosombindning och efterföljande avlägsnande från cellen via lysosomfusion. Mitophagy är viktigt för cellulär homeostas, och mutationer i Parkin är kopplade till Parkinsons sjukdom (PD). På grund av dessa fynd har det lagts stor vikt vid att undersöka mitokondriella skador och omsättning för att förstå de molekylära mekanismerna och dynamiken i mitokondriell kvalitetskontroll. Här användes levande cellavbildning för att visualisera det mitokondriella nätverket av HeLa-celler, för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer efter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Dessutom uttrycktes en PD-länkad mutation av Parkin (Parkin^T240R) som hämmar Parkin-beroende mitofagi för att bestämma hur mutantuttryck påverkar mitokondriellt nätverk jämfört med celler som uttrycker Parkin av vildtyp. Protokollet som beskrivs här beskriver ett enkelt arbetsflöde med fluorescensbaserade metoder för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer effektivt.