מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

Summary

פרוטוקול זה מדגים מדידות פיזור ראמאן משופר פני שטח (SERS) של מולקולה אחת באמצעות ננו-אנטנת אוריגמי של DNA (DONA) בשילוב עם מיקרוסקופ כוח אטומי מקומי (AFM) ומדידות ראמאן.

Abstract

לפיזור ראמאן משופר פני השטח (SERS) יש את היכולת לזהות מולקולות בודדות שעבורן נדרש שיפור שדה גבוה. SERS של מולקולה יחידה (SM) מסוגל לספק מידע ספקטרוסקופי ספציפי למולקולות על מולקולות בודדות ולכן מניב מידע כימי מפורט יותר מאשר טכניקות אחרות לזיהוי SM. יחד עם זאת, קיים פוטנציאל לפענח מידע ממדידות SM שנותר חבוי במדידות ראמאן של חומר בתפזורת. פרוטוקול זה מתאר את מדידות SM SERS באמצעות ננו-אנטנת אוריגמי DNA (DONA) בשילוב עם מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) וספקטרוסקופיית ראמאן. מבנה מזלג אוריגמי DNA ושני ננו-חלקיקי זהב משולבים ליצירת DONAs, עם פער של 1.2-2.0 ננומטר ביניהם. זה מאפשר שיפור אות SERS של עד פי¹¹, המאפשר מדידות של מולקולות בודדות. הפרוטוקול מדגים גם את המיקום של מולקולת אנליט בודדת בנקודה חמה של SERS, את התהליך של דימות AFM, ואת הכיסוי הבא של דימות ראמאן כדי למדוד אנליט ב-DONA יחיד.

Introduction

DNA אוריגמי היא טכניקת ננוטכנולוגיה הכוללת קיפול גדילי DNA לצורות ודפוסים ספציפיים. היכולת ליצור מבנים עם שליטה מדויקת בקנה מידה ננומטרי היא אחד היתרונות המרכזיים של DNA אוריגמי¹. ליכולת לתמרן חומר בקנה מידה כה קטן יש פוטנציאל לחולל מהפכה במגוון רחב של תחומים, כולל רפואה, אלקטרוניקה ומדעי החומרים². לדוגמה, מבני אוריגמי DNA שימשו להעברת תרופות ישירות לתאים סרטניים ^3,4, ליצירת חיישנים ננומטריים לגילוי מחלות^5,6, וליצירת תבניות מורכבות על פני השטח של חומרים ^6,7. יתר על כן, היכולת להשתמש באוריגמי DNA כדי ליצור מבנים ננומטריים מורכבים יצרה הזדמנויות חדשות לחקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים בקנה מידה ננומטרי⁸.

פיזור ראמאן משופר פני השטח (SERS) היא טכניקה אנליטית חזקה המזהה ומזהה מולקולות בריכוזים נמוכים ביותר⁹. הוא מבוסס על אפקט ראמאן, שהוא שינוי באורך הגל של אור מפוזר¹⁰. SERS דורש מצע מתכת פלסמוני כדי להגביר את אות הרמאן של מולקולות הנספגות עליו. שיפור זה יכול להיות גדול עד פי 10^{פי 11} מהאות המתקבל מאותה מולקולה שנמדדה על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית, מה שהופך את SERS לשיטה רגישה ביותר לניתוח כמויות זעירות של חומרים¹¹.

שיפור אות הרמאן של ננו-חלקיקים נובע בעיקר משיפור אלקטרומגנטי המבוסס על עירור של תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח (LSPR)¹². בתופעה זו, אלקטרונים בתוך ננו-חלקיק המתכת מתנודדים באופן קולקטיבי סביב פני השטח של ננו-חלקיק המתכת במהלך היארעות האור. התוצאה היא יצירת גל עומד של אלקטרונים המכונה פלסמון פני השטח, אשר יכול להדהד עם אור האירוע. ה-LSPR משפר מאוד את השדה החשמלי ליד פני השטח של החלקיק, והבליעה האופטית של החלקיק היא מקסימלית בתדר התהודה של פלסמון. האנרגיה של פלסמון פני השטח תלויה בצורה ובגודל של ננו-חלקיק המתכת, כמו גם בתכונות של התווך הסובב אותו¹³. שיפור גבוה יותר יכול להיות מושג עוד יותר על ידי צימודים פלסמוניים, כגון כאשר שני ננו-חלקיקים קרובים זה לזה במרחק של בערך פי 2.5 מהקוטר או פחות^מ-14. הקרבה גורמת ל-LSPR של שני הננו-חלקיקים לתקשר זה עם זה, מה שמגביר את השדה החשמלי במרווח בין החלקיקים בכמה סדרי גודל, הרבה מעבר להשבחה של ננו-חלקיק בודד^15,16,17. גודל ההשבחה עומד ביחס הפוך למרחק בין הננו-חלקיקים; ככל שהמרחק קטן, מופיעה נקודה קריטית שבה השיפור מספיק כדי לזהות מולקולות בודדות (SMs)¹⁸.

DNA אוריגמי מייצג טכנולוגיית מפתח שיכולה לארגן ביעילות ננו-חלקיקים פלסמוניים כדי לנצל ולייעל את הצימוד הפלזמוני¹⁹. יחד עם זאת, מולקולות מעניינות ניתן להציב בדיוק במקום שבו גילוי אופטי הוא היעיל ביותר. זה הוכח עם ננו-אנטנות פלסמוניות מבוססות DNA אוריגמי לזיהוי פלואורסצנטיות²⁰. בניגוד לזיהוי תוויות פלואורסצנטיות, SERS מספק את האפשרות לזהות טביעת אצבע כימית ישירה של מולקולה, מה שהופך את SERS המולקולה הבודדת לאטרקטיבית מאוד לחישה, כמו גם לניטור תגובות כימיות ומחקרים מכניסטיים. דנ"א אוריגמי יכול לשמש גם כמסכה לייצור ננו-מבנים פלסמוניים בעלי צורות מוגדרות היטב²¹, אם כי האפשרות למקם מולקולות מטרה במדויק בנקודה החמה הולכת לאיבוד.

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי מקומי (AFM) ומדידות ראמאן, אנו יכולים לקבל את ספקטרום הרמאן מננו-אנטנה אחת של אוריגמי DNA (DONA) ואולי ממולקולה בודדת אם היא ממוקמת במיקום של שיפור האות הגבוה ביותר. ה-DONA מורכב ממזלג אוריגמי DNA ושני ננו-חלקיקים הממוקמים במדויק, המצופים במלואם ב-DNA המשלים לגדילים המורחבים המחוברים לאוריגמי ה-DNA. עם הכלאת הדנ"א, הננו-חלקיקים קשורים למזלג האוריגמי של הדנ"א עם מרווח של 1.2-2.0 ננומטר בין משטחי הננו-חלקיקים²². הרכבה כזו יוצרת נקודה חמה בין הננו-חלקיקים עם שיפור אות של עד פי 10 פי¹¹, כפי שמחושב מסימולציות תחום זמן הפרש סופי (FDTD)²², ובכך מאפשר מדידות SM SERS. עם זאת, נפח ההשבחה הגבוהה ביותר הוא קטן (בטווח של 1-10 ננומטר³ ), ולכן מולקולות המטרה צריכות להיות ממוקמות בדיוק בנקודה חמה זו. מזלג אוריגמי DNA מאפשר מיקום של מולקולה בודדת בין שני הננו-חלקיקים באמצעות גשר מזלג DNA וכימיית צימוד מתאימה. אף על פי כן, התבוננות בהודעות SM כאלה בספקטרום ראמאן מאתגרת מאוד²² . לחלופין, ניתן לצפות את הננו-חלקיקים באופן מלא במולקולת המטרה, כגון צבע TAMRA, כדי לאפשר מדידות DONA בודדות בעוצמת SERS גבוהה יותר²¹. במקרה זה, ה-TAMRA מחובר באופן קוולנטי לגדיל ציפוי הדנ"א (איור 1).

Protocol

1. הרכבת מזלג אוריגמי DNA

1. הרכבה עצמית של מבנה האוריגמי DNA בסיר אחד. ראשית, הוסף גדיל פיגום עגול M13mp18 של 2.5 ננומטר (7,249 נוקלאוטידים, ראה טבלת חומרים) ו-100 ננומטר של 201 אוליגונוקלאוטידים קצרים (טבלה 1) ב-1x TAE (tris[hydroxymethyl]aminomethane [tris], חומצה אצטית, אתילאנדיאמין חומצה אצטית [EDTA]) בתוספת חיץ₁₅ mM MgCl 2. לאחר מכן, התאם את הנפח הכולל ל -100 μL באמצעות מים טהורים במיוחד.
2. אנאל את התמיסה לאחר מכן על ידי שיפוע טמפרטורה ב thermocycler, תחילה על ידי חימום מהיר ל 80 ° C, ולאחר מכן על ידי קירור מ 80 ° C ל 20 ° C ב 1 ° C / 12 דקות, ולאחר מכן מ 20 ° C ל 16 ° C ב 1 ° C / 6 דקות, ולאחר מכן קירור מהיר מ 16 ° C ל 8 ° C.
3. השתמש במסנני Amicon של 100 kDa לחיתוך משקל מולקולרי (MWCO) (ראה טבלת חומרים) כדי לטהר את התערובת מעודפי סיכות.
   1. הוסף 100 μL של תמיסת אוריגמי DNA למסנני Amicon, כמו גם 400 μL של מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. השליכו את המסנן על ידי הסרת המסנן והפיכת הצינור כדי להסיר את השטיפה בכיור, ולאחר מכן הוסיפו שוב 400 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד למסנן ולצנטריפוגה. חזור על שלב זה פעם נוספת.
   3. כדי לאסוף את תמיסת הננו-מבנה המטוהר, הפוך את המסנן בצינור ובצנטריפוגה חדשים (1,000 x גרם, 2 דקות, RT) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). פתרון זה ניתן לאחסן במקרר ב 8 ° C עד 2 שבועות.
      הערה: יש להשתמש במאגר TAE 1x או 1x TAE בתוספת חיץ 15 mM MgCl₂ במקום מים טהורים במיוחד לשלב טיהור מסנן Amicon, מכיוון שמים מפחיתים את היציבות ומורידים את ריכוז מזלגות האוריגמי של ה- DNA המתקבלים. למדידת מולקולת צבע יחידה, תערובת גדילי סיכות הדנ"א מוחלפת בתערובת גדילים שונה המכילה צבע TAMRA בקצה 5 אינץ'. גדיל שונה זה נמצא באמצע גשר ננו-מזלג (טבלה 2).

2. ציפוי ננו-חלקיקי זהב (AuNP)

הערה: גרסה שונה של פרוטוקול Liu et ^al.23 שימשה לציפוי AuNPs, ותהליך הציפוי כלל הקפאת תמיסת AuNP-DNA.

1. צנטריפוגה (3,500 x גרם, 5 דקות, RT) 400 μL של תמיסת AuNP בקוטר 60 ננומטר (מתקבלת מסחרית; ראה טבלת חומרים), ובאמצעות פיפטה, להסיר את supernatant. לאחר מכן, resolubilize את הגלולה ב 25 μL של מים טהורים במיוחד. הריכוז הסופי של AuNPs הוא ~ 0.3 nM.
2. הוסף 1 μL של 100 mM תמיסת tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ל-4 μL של DNA מהונדס בתיול (100 μM כפי שסופק על-ידי היצרן; ראה טבלת חומרים) ודגור במשך 10 דקות ב-RT.
3. לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת 5 μL לתמיסת AuNP המרוכזת (שלב 2.1), מערבולות למשך 5 שניות, ומקפיאים למשך שעתיים לפחות ב -20 מעלות צלזיוס.
4. לאחר הפשרה ב-RT, צנטריפוגה (3,500 x גרם, 5 דקות, RT) את התערובת כדי להסיר את ה-DNA הציפוי שנוסף יתר על המידה. בעזרת פיפטה, להסיר את supernatant, ו reublize את הגלולה ב 10 μL של מים.
   הערה: ישנם שני גדילי ציפוי עבור כל אחד מה-AuNPs בננו-מזלג (טבלה 2). השלבים זהים למעט רצף גדיל ציפוי הדנ"א. ברגע שהחלקיקים מצופים, הם יציבים מאוד; הם יכולים להישאר כפי שהם במשך חודשים במקרר ואפילו ניתן להקפיא אותם. עבור AuNPs של צבע בציפוי מלא, גדילי ה- DNA המצפים הם בעלי צבע TAMRA פנימי.

3. הרכבה של דונה

1. הוסף את תמיסת AuNP המצופה לתמיסת ננו-מזלג, עם יחס מולארי ריכוז של 1.5:1.
2. הוסף את MgCl 2 לריכוז סופי של 4 mM באמצעות תמיסת מלאי MgCl₂ של 50 mM. כוונן את הנפח הסופי ל- 20 μL באמצעות מים טהורים במיוחד.
3. הכלאה של DONAs באמצעות שיפוע טמפרטורה בתרמוסייקלר. ראשית, יש לחמם במהירות ל-40°C, לאחר מכן לקרר מ-40°C עד 20°C ב-1°C/10 דקות, ולאחר מכן לקרר במהירות מ-20°C עד 8°C.

4. אלקטרופורזה ג'ל

הערה: הננו-חלקיקים הבלתי קשורים בתמיסת DONA מוסרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

1. הכינו ג'ל אגרוז 1%. לשם כך, להמיס 0.8 גרם של agarose ב 80 מ"ל של 1x TAE בתוספת 5 mM MgCl₂.
2. הוסף 2.25 μL של מאגר העמסה (30% גליצרול, 13 mM MgCl 2; ראה טבלת חומרים) ל- 18 μL של תמיסת DONA כדי להגיע לריכוז סופי של 5 mM MgCl 2 מ- 4 mM בשלב_3.2. מאגר ההעמסה גם מבטיח שהדגימה תישאר בתוך כיס הג'ל.
3. הפעל את הג'ל במשך 60 דקות ב 70 V באמבט מי קרח. מאגר הריצה הוא 1x TAE בתוספת 5 mM MgCl_2.
4. גזרו את הרצועה המעניינת והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופיה עטופה בסרט פלסטיק פרפין, ולאחר מכן סחטו את התמיסה באמצעות שקופית מיקרוסקופית שנייה עטופה בסרט פלסטיק פרפין. בעזרת פיפטה, לאסוף את הנוזל סחוט לתוך צינור 500 μL.

5. קולוקליזציה של מדידות AFM ורמאן

1. פלזמה לטפל שבב סיליקון (ראה טבלה של חומרים) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לדגור 10 μL של תמיסת DONA מטוהר בתוספת 10 μL של 100 mM MgCl₂ על השבב במשך 3 שעות. לאחר מכן, שטפו את השבב פעמיים בתערובת של 1:1 (לפי נפח) של אתנול ומים וייבשו במכה עם אוויר דחוס. לאחר מכן, הדביקו את השבב על דיסק מגנטי והכניסו אותו למכשיר להדמיה.
   הערה: לפני תחילת המדידות, המיקום של לייזר עירור ראמאן מותאם להיות על גבי קצה הבדיקה AFM. בעבודה הנוכחית נעשה שימוש במיקרוסקופ HORIBA LabRAM HR Evolution Raman המשולב ל-HORIBA Omegascope AFM. המכשיר נשלט באמצעות התוכנה LabSpec ו-AIST.
2. למדידת AFM, השתמש במצב הקשה (מצב AC) עם עצות ACCESS-NC-A (תדר תהודה: 300 kHz; קבוע קפיץ: 45 N/m)²⁴. מצב AC שולט אוטומטית בכל הפרמטרים, למעט קצב הסריקה, המוגדר ל- 1 הרץ.
   הערה: לאחר הדמיית AFM, קצה ה-AFM נסוג כך שהוא לא נמצא בנתיב של לייזר הרמאן. זה נעשה באמצעות פונקציית מאקרו, "בדיקה משם", מתוכנת במערכת. בדרך זו, עבור כל נקודה שנבחרה בתמונת AFM, הלייזר יהיה באותו מיקום ללא היסט בהשוואה ל- AFM.
3. בחר את אורך גל הלייזר הרצוי, הספק וזמן הצטברות למדידות ראמאן, שכן כל הפרמטרים הללו תלויים במדגם הנמדד.
   1. השתמש בפרמטרים שהוזכרו למדידת TAMRA AuNP בציפוי מלא: לייזר 633 ננומטר, הספק 100 μW וזמן אינטגרציה של 1 שניות.
   2. השתמש בפרמטרים שהוזכרו למדידת TAMRA יחידה: לייזר 633 ננומטר, הספק 400 μW וזמן אינטגרציה של 4 שניות.
4. לאחר התאמת הפרמטרים, מקם את הסמן על גבי ה- DONA הרצוי בתמונת AFM; הפונקציה "העבר סמן" בתוכנה עושה זאת. לאחר מכן, התחל את מדידת הרמאן.
   הערה: ישנם מצבים שונים לרכישת הספקטרה: מדידה של נקודה אחת - מיפוי זמן חד-ממדי - שבו נקודה בודדת נמדדת לאורך זמן²⁵; ומיפוי שטח XY דו-ממדי, שבו שלב ממונע מועבר מתחת ללייזר כדי לקבל ספקטרום ממערך של נקודות ברשת XY²⁶.

Discussion

SM SERS הוא כלי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לחקור את ההתנהגות והאינטראקציות של מולקולות בודדות בתוך מדגם¹. טכניקה כזו מאפשרת ניתוח של מערכות ברמת רגישות חסרת תקדים, מספקת תובנות חדשות על ההתנהגות הבסיסית של מולקולות בודדות ועל התפלגות התכונות הכימיות או הפיזיקליות על פני אנסמבל של מולקולות, ומסייעת לזהות מתווכים רלוונטיים בתהליכים כימיים. עם זאת, הצבת מולקולה בודדת בנקודה החמה תוך וידוא שלנקודה החמה יש מספיק שיפור פני השטח יכולה להיות מאתגרת למדי²⁷. הדונ"א המתואר בפרוטוקול זה יכול למקם במדויק מולקולה בודדת בנקודה החמה בין שני ננו-חלקיקי זהב תוך הבטחת שיפור פני השטח פי 10 פי¹¹.

הפער בין הננו-חלקיקים הוא קריטי עבור מכלול DONA כדי להגיע לשיפור פני השטח הנדרש עבור מחקרי SM SERS. ה-DONAs מותאמים לננו-חלקיקים כדוריים בגדלים שבין 60 ל-80 ננומטר. יתר על כן, איכות הננו-חלקיקים יכולה להשפיע באופן משמעותי על הכלאת הננו-חלקיקים עם מזלגות האוריגמי של ה-DNA; כאשר הננו-חלקיקים המשמשים בשלב הציפוי הם מעל 6 חודשים, יעילות ההכלאה מתחילה לרדת.

היבט קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא שיש לעקוב במדויק אחר השלבים הדורשים יחס מדויק בין רכיבים, אחרת ה- DONAs לא ייווצרו כראוי. מזלג האוריגמי DNA רגיש ביותר לפרוטוקול השתוללות הטמפרטורה, עם שינויים המשפיעים על שלמות המבנה או מונעים היווצרות מזלגות.

ייצור פחמן אמורפי הוא נושא משמעותי במהלך מדידות SERS מכיוון ששיאו הוא בדרך כלל באותו טווח כמו שטח טביעת האצבע של מולקולות רבות (1,200-1,700 סמ"^ק-1). בעוד המבנה עדיין לא מובן במלואו, זה קשור בדרך כלל עם כוח לייזר גבוה או אינטגרציה ארוכה פעמים²⁸. כאמצעי זהירות, יש להשתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר ובזמן האינטגרציה הקצר ביותר האפשרי. עם זאת, זה לא קל להשגה כי יש לאזן בין קבלת אות SERS הרצוי לבין הימנעות מיצירת פחמן אמורפי.

ה-DONAs הם מאוד רב-תכליתיים כמערכת SM לגבי הסוגים והצורות השונים של ננו-חלקיקים שניתן להשתמש בהם, כגון כדורי כסף, פרחי זהב או כוכבים. בנוסף, המולקולה הנחקרת יכולה להיות מוחלפת בקלות על ידי שינוי גדיל הדנ"א בלבד במרכז הגשר, ללא שינויים בהליך. מעבר לחלבונים כמו ציטוכרום C יכול להיעשות על ידי גדיל לכידת DNA מהונדס פירידין בגשר, אשר יקשור את הציטוכרום C ויבטיח שהוא נמצא במקום החם למדידות SM SERS²². זה גם מתורגם לבחירה גמישה של הלייזר לקרינה, אולי באמצעות לייזר שנותן שיפור מקסימלי.

לסיכום, שיטה זו אמינה להרכבת מבני DONA ושימוש בהם למדידות ספקטרוסקופיית ראמאן משופרת על פני השטח של מולקולה אחת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL	Merck	UFC5100BK
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA)	SIGMA Aldrich	T9650
60 nm goldspheres, bare (citrate)	NanoComposix	AUCN60
ACCESS-NC-A AFM probes	SCHAEFER-TEC
Agarose powder	SIGMA Aldrich	9012-36-6
AuNP DNA coating strands	IDT
AuNP DNA coating strands (TAMRA)	SIGMA Aldrich
Glycerol	SIGMA Aldrich	56-81-5
Heraeus Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution	HORIBA
Magnesium chloride	SIGMA Aldrich	7786-30-3
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA)	Metabion
Nanofork DNA staple strands	SIGMA Aldrich
ParafilmM	Carl Roth	CNP8.1
Primus 25 Thermocycler	Peqlab/VWR
Silicon wafer	Siegert wafer	BW14076
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18)	Tilibit nanosystems
TCEP solution	SIGMA Aldrich	51805-45-9