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Abstract

Biology

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

Published: June 2nd, 2023

DOI:

10.3791/65311

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Abstract

기능적 부위 지정 형광 측정법은 전압 개폐 이온 채널을 포함한 수많은 막 단백질의 구조-기능 관계를 조사하기 위해 선택되는 기술이었습니다. 이 접근법은 주로 이종 발현 시스템에서 멤브레인 전류, 채널 활동의 전기적 발현 및 형광 측정을 동시에 측정하여 로컬 도메인 재배열을 보고하는 데 사용되었습니다. 기능적 부위 지정 형광 측정법은 전기 생리학, 분자 생물학, 화학 및 형광을 형광 및 전기 생리학을 통해 실시간 구조 재배열 및 기능을 연구할 수 있는 광범위한 단일 기술로 결합합니다. 일반적으로 이 접근 방식에는 티올 반응성 형광 염료로 테스트할 수 있는 시스테인을 포함하는 엔지니어링된 전압 개폐 멤브레인 채널이 필요합니다. 최근까지 단백질의 부위 지향 형광 표지에 사용된 티올 반응성 화학은 Xenopus 난모세포 및 세포주에서만 수행되어 1차 비흥분성 세포에 대한 접근 범위를 제한했습니다. 이 보고서는 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링의 초기 단계를 연구하기 위해 성인 골격근 세포에서 기능적 부위 지시 형광 측정법의 적용 가능성을 설명합니다. 본 프로토콜은 생체 내 전기천공을 사용하여 시스테인 공학 전압 개폐 Ca2+ 채널(CaV1.1)을 설계하고 성인 마우스의 굴근 손가락 브레비스의 근육 섬유로 형질감염시키는 방법론과 기능적 부위 지정 형광 측정 측정에 필요한 후속 단계를 설명합니다. 이 접근법은 다른 이온 채널과 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 포유류 근육의 기능적 부위 지정 형광 측정법의 사용은 특히 흥분성의 기본 메커니즘을 연구하는 것과 관련이 있습니다.

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